枇杷葉總黃酮的減壓內(nèi)部沸騰提取工藝研究*

翁艷英，張貞發(fā)

(廣西民族師范學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 崇左 532200)

枇杷葉，別名巴葉、蘆桔葉，分布廣泛，作為傳統(tǒng)中藥，具有清肺、止咳、抗炎等功效[1]。研究表明枇杷葉提取物具有抗感染、抗病毒、降血糖等藥理作用[2]，而其含有的豐富黃酮類化合物[3]具有明顯的抗氧化作用[4-5]，并對(duì)小鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用[6]。

目前，對(duì)枇杷葉總黃酮的提取工藝研究已有報(bào)道，如回流提取[7-8]，提取時(shí)間較長(zhǎng)；超聲提取[9]，提取30 min，枇杷葉總黃酮得率為7.23%；纖維素酶輔助提取[10]，提取80 min，正交實(shí)驗(yàn)中枇杷葉總黃酮含量最高值為11.32 mg/g。近年來(lái)，減壓內(nèi)部沸騰法已成功應(yīng)用到多種天然產(chǎn)物總黃酮[11-12]的提取中，該法既能保證活性成分提取率，又具有提取時(shí)間短，提取溫度低，易操作的顯著特點(diǎn)。由此，本實(shí)驗(yàn)以枇杷葉為原料，通過(guò)減壓內(nèi)部沸騰法提取總黃酮，考察提取劑濃度、提取劑用量、提取溫度及提取時(shí)間等因素的影響，并在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上正交優(yōu)化提取工藝，為枇杷資源的綜合開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與試劑

1.1 材 料

枇杷葉，購(gòu)于崇左市藥材市場(chǎng)，烘干、粉碎備用。

1.2 試 劑

蕓香葉苷對(duì)照品(AR)；無(wú)水乙醇(AR)；硝酸鋁(AR)；亞硝酸鈉(AR)；氫氧化鈉(AR)。

1.3 儀 器

722型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；循環(huán)水式多用真空泵，河南省予華儀器有限公司；超級(jí)恒溫水浴鍋，南京大學(xué)應(yīng)用物理研究所；電子天平，奧豪斯儀器上海有限公司。

1.4 方 法

1.4.1 減壓內(nèi)部沸騰提取枇杷葉總黃酮

準(zhǔn)確稱取0.50 g枇杷葉粉末，采用60%乙醇解吸20 min，然后按照?qǐng)D1進(jìn)行總黃酮的減壓內(nèi)部沸騰提取兩次，合并濾液，獲得總黃酮提取液，備用。

圖1 枇杷葉總黃酮的提取流程圖

1.4.2 枇杷葉總黃酮的含量測(cè)定

(1)總黃酮的含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[13]對(duì)枇杷葉的總黃酮進(jìn)行含量測(cè)定。取1.20 mL枇杷葉總黃酮提取液于25.00 mL比色管，加入30%的乙醇溶液至12.50 mL，搖勻，加入0.70 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的亞硝酸鈉溶液，搖勻后靜置5 min，然后加入0.70 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的硝酸鋁溶液，搖勻后靜置6 min，接著加入5.00 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的氫氧化鈉溶液，搖勻，30%的乙醇溶液定容。采用試劑空白做參比，在510 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算總黃酮的含量。

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精確稱取蕓香葉苷0.0225 g，30%乙醇溶解，定容至100 mL。分別量取0.00 mL，1.20 mL，2.40 mL，4.80 mL，7.20 mL，9.60 mL質(zhì)量濃度為0.255 g/L的蕓香葉苷標(biāo)準(zhǔn)溶液于25.00 mL比色管，按照總黃酮含量測(cè)定步驟進(jìn)行顯色分析，于510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以吸光度和蕓香葉苷濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，蕓香葉苷濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程為A=8.7627C+0.00516，其中A為吸光度，C為蕓香葉苷濃度(g/L)，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998，見(jiàn)圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

(3)總黃酮提取率計(jì)算公式

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及提取率公式計(jì)算枇杷葉總黃酮的提取率，公式見(jiàn)式(1)。

(1)

1.4.3 單因素實(shí)驗(yàn)

稱取0.50 g枇杷葉粉末，60%乙醇進(jìn)行解吸20 min，以乙醇溶液作為提取劑，0.055 MPa壓力下進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

固定15 mL提取劑，提取溫度 60 ℃，提取時(shí)間4 min的條件，改變提取劑乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%)，考察提取劑乙醇濃度對(duì)枇杷葉總黃酮提取率的影響。

固定15 mL提取劑，提取溫度 60 ℃，提取劑濃度70%的條件，改變提取時(shí)間(2 min、4 min、6 min、8 min、10 min)，考察提取時(shí)間對(duì)枇杷葉總黃酮提取率的影響。

固定15 mL提取劑，提取時(shí)間6 min，提取劑濃度70%的條件，改變提取溫度(50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃)，考察提取溫度對(duì)枇杷葉總黃酮提取率的影響。

固定提取劑濃度70%，提取時(shí)間6 min，提取溫度70 ℃的條件，改變提取劑乙醇用量(20 mL、25 mL、30 mL、35 mL、40 mL)，考察提取劑乙醇用量對(duì)枇杷葉總黃酮提取率的影響。

1.4.4 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，研究提取劑乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度及提取劑用量四個(gè)因素對(duì)枇杷葉總黃酮提取率的影響。正交實(shí)驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因子水平

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)枇杷葉總黃酮提取率的影響如圖3所示。由圖3可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，枇杷葉中總黃酮提取率也增大，當(dāng)提取時(shí)間為6 min時(shí)提取率最大，隨后枇杷葉總黃酮的提取率反而下降。因此選擇4 min、6 min、8 min三水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖3 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

2.1.2 提取劑濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

提取劑濃度對(duì)枇杷葉總黃酮提取率的影響如圖4所示。從圖4可以看出，提取劑濃度小于70%時(shí)，枇杷葉中總黃酮的提取率快速增長(zhǎng)，繼續(xù)提高提取劑濃度，總黃酮提取率呈下降趨勢(shì)。因此選擇60%、70%、80%三水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖4 提取劑濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

2.1.3 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

提取溫度對(duì)枇杷葉總黃酮提取率的影響如圖5所示。由圖5可知，低溫不利于枇杷葉物料內(nèi)部沸騰，提取率不高；隨著溫度的升高，溶劑分子運(yùn)動(dòng)激烈，70 ℃時(shí)提取率最高，主要是55 kPa的提取壓力條件下，70%乙醇沸點(diǎn)為70 ℃左右[14]，此時(shí)枇杷葉物料內(nèi)部得到充分沸騰，強(qiáng)化了傳質(zhì)過(guò)程，使提取效果達(dá)到最佳。再持續(xù)升溫，可能造成雜質(zhì)溶出率增大及黃酮結(jié)構(gòu)被破壞[15]，使枇杷葉總黃酮提取率減小。因此選擇60 ℃、70 ℃、80 ℃三水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖5 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

2.1.4 提取劑用量對(duì)總黃酮提取率的影響

提取劑用量對(duì)枇杷葉總黃酮提取率的影響如圖6所示。從圖6可知，對(duì)0.50 g物料，隨著提取劑用量的增加，枇杷葉總黃酮提取率也增大，當(dāng)提取劑乙醇用量在30 mL時(shí)總黃酮的提取率最高。繼續(xù)增加提取劑用量大于30 mL時(shí)，提取率下降并趨于平穩(wěn)，這與提取劑用量大使其擴(kuò)散速率大，增加了雜質(zhì)的溶出率有關(guān)。因此選擇25 mL、30 mL和35 mL三水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖6 提取劑用量對(duì)總黃酮提取率的影響

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

按表1的正交因子水平設(shè)計(jì)的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映了減壓內(nèi)部沸騰提取枇杷葉總黃酮的最佳組合為A2B2C2D2，即70%乙醇作為提取劑且提取劑乙醇用量為30 mL，在70 ℃條件下減壓提取6 min。對(duì)正交實(shí)驗(yàn)最佳組合進(jìn)行三組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，分別稱取0.50 g的枇杷葉粉末3份，60%乙醇解吸20 min，加入30 mL 70%乙醇，在70 ℃、0.055 MPa條件下提取6 min，提取兩次。結(jié)果顯示，枇杷葉總黃酮提取率平均值達(dá)到9.48%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分驗(yàn)證了正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到的最佳提取工藝的合理性。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié) 論

通過(guò)減壓內(nèi)部沸騰法提取枇杷葉總黃酮，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，提取枇杷葉總黃酮的最佳工藝參數(shù)為：0.50 g的枇杷葉粉末，60%乙醇解吸20 min，提取劑濃度為70%，提取劑用量為30 mL，在70 ℃和0.055 MPa條件下提取2次，每次6 min，此條件下總黃酮提取率為9.48%。減壓內(nèi)部沸騰提取工藝具有提取時(shí)間短，提取溫度低，提取裝置簡(jiǎn)單、成本低，易操作等特點(diǎn)，這將為枇杷葉總黃酮的活性研究提供理論數(shù)據(jù)，并為枇杷資源的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。