轉(zhuǎn)Cry抗蟲基因玉米對家蠶的安全性評價

姜媛媛，紀(jì) 藝，來勇敏，陳笑蕓，徐俊鋒，徐曉麗，*，馬蓮菊

(1.農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險防控國家重點實驗室(籌)，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州310021；2.沈陽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽 110034)

2020年1月21日農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技教育司發(fā)布《2019年農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書(生產(chǎn)應(yīng)用)批準(zhǔn)清單》(http://www.moa.gov.cnztzlzjyqwgzspxx201912/t20191230_6334015.htm)，批準(zhǔn)了2個轉(zhuǎn)Bt(Bacillusthringensis)基因抗蟲玉米品種獲得安全證書，這標(biāo)志著轉(zhuǎn)基因玉米在我國的商業(yè)化種植進程邁出了重大的一步。隨著轉(zhuǎn)基因植物的大面積推廣應(yīng)用，我們在關(guān)注其所帶來的巨大社會、經(jīng)濟和生態(tài)效益時，也需要考察其對生態(tài)環(huán)境等方面可能產(chǎn)生的不利影響。目前商業(yè)化種植面積較廣的轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米的靶標(biāo)害蟲通常為鱗翅目害蟲，而家蠶與其靶標(biāo)害蟲具有較近的親緣關(guān)系，在長期馴養(yǎng)過程中，家蠶的抗逆性明顯減弱，極易受到外界各種因素的影響。我國家蠶飼養(yǎng)產(chǎn)業(yè)在近些年由于東桑西移[1]，使主要分布在江浙一帶的稻?；旆N的種植模式發(fā)生了變化，養(yǎng)蠶業(yè)在全國的很多地區(qū)都有發(fā)展，有可能存在玉米種植區(qū)與家蠶飼養(yǎng)區(qū)相重疊的現(xiàn)象。由于玉米在散粉期向周圍環(huán)境中釋放大量的花粉，當(dāng)表達Bt蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米花粉漂移到鄰近的桑田時，有可能被家蠶取食，從而對家蠶飼養(yǎng)產(chǎn)生影響。

采用轉(zhuǎn)基因植物花粉為試驗材料評價其對家蠶的生態(tài)安全性目前已有許多的報道，多數(shù)研究針對轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻。如王忠華等[2]評價了轉(zhuǎn)cry1Ab基因水稻“克螟稻”對家蠶生長發(fā)育的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論非Bt水稻還是Bt水稻花粉處理對家蠶體重均有較大影響，但對致死率無顯著影響，其采用的花粉密度為100?！-2，認(rèn)為實際生態(tài)條件下桑葉上花粉濃度可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于試驗條件，因此認(rèn)為稻桑共作環(huán)境下，“克螟稻”花粉對家蠶生長發(fā)育不會造成太大的影響。Yao等[3]測試了轉(zhuǎn)cryAb/cryAc融合抗蟲基因水稻TT9-3對家蠶的影響，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因水稻花粉在桑葉表面分布達3 395粒·cm-2的情況下處理蟻蠶48 h對其存活率和生長發(fā)育無顯著影響，這一花粉分布密度高于稻桑共作環(huán)境下桑葉上檢測到的最高花粉分布密度(1 635.9粒·cm-2)。Yang等[4]研究發(fā)現(xiàn)，家蠶幼蟲短期(3 d)暴露于高密度的表達Cry1C或Cry2A蛋白的轉(zhuǎn)基因水稻花粉對其生長發(fā)育無顯著影響，但高于150?！m-2的全生育期暴露時，家蠶14 d體重降低，發(fā)育歷期延長，成蟲羽化率降低，認(rèn)為自然環(huán)境下的暴露水平遠(yuǎn)低于實驗條件下的暴露水平，轉(zhuǎn)Bt基因水稻花粉對家蠶的風(fēng)險可以忽略。Niu等[5]測試了單獨表達Cry1Ac和表達Cry1Ac/Cry2Ab復(fù)合性狀的棉花花粉飼喂7 d后對家蠶的影響，僅在較高密度處理組(900和8 000粒·cm-2)觀測到有限的影響，認(rèn)為測試的兩種棉花花粉對家蠶的風(fēng)險可以忽略。常雪[6]研究了3種轉(zhuǎn)基因玉米N30、V3和J223(分別表達Cry1Ab/Cry2Aj、Cry1Ab/Vip3DA和Cry1Ab/Cry1I)對家蠶的影響，發(fā)現(xiàn)花粉濃度為40 mg·mL-1，約10 000?！m-2的密度涂在桑葉上時，家蠶在14 d后全部死亡。當(dāng)桑葉上花粉密度為4 mg·mL-1，約1 000?！m-2時，對家蠶幼蟲存活、繭重和繭殼重沒有不利影響，但各齡眠蠶體重減輕，發(fā)育歷期延長。當(dāng)桑葉上的花粉密度為0.4 mg·mL-1，約100 ?！m-2時，家蠶的生長發(fā)育不受Bt花粉的影響。

研究發(fā)現(xiàn)，不同的Bt蛋白對家蠶的毒性不同，Jiao等[7]檢測了Cry1Fa、Cry1Ca、Cry2Aa、Cry1Ab和Cry1Ac等5種不同的Bt蛋白對家蠶的毒性，發(fā)現(xiàn)對家蠶毒性最大的為Cry1Fa，而Cry1Ac的毒性最低。另外，不同品種的家蠶對同一Bt蛋白的敏感性差異也非常大，有研究發(fā)現(xiàn)，不同品種的家蠶對Cry1Ab的敏感性差異達25 000倍[8]。因此，家蠶也常常被用來作為研究鱗翅目昆蟲對Bt毒素抗性的模式生物。Endo等[9]認(rèn)為，家蠶中腸ABCC轉(zhuǎn)運蛋白對Cry毒素的親和性與其對Cry的敏感性有很大的關(guān)系。Cry1和Cry2是轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米中應(yīng)用最多的抗鱗翅目Bt毒素，其中Cry1Ab是應(yīng)用最為廣泛的，如Bt11、Bt176和MON810中均使用了Cry1Ab，我國最近新批準(zhǔn)的2個抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米新品系DBN9936和雙抗12-5也均采用Cry1Ab抗蟲基因。在玉米上應(yīng)用的其他Cry1基因還有Cry1C、Cry1F和Cry1A.105(包含了Cry1Ab、Cry1F和Cry1Ac)，另外較常用的還有Cry2A，如MON89034中同時表達Cry2Ab2和Cry1A.105。在本研究中，我們測試了轉(zhuǎn)基因玉米GAB-3花粉對家蠶的毒性，并采用飼料飼養(yǎng)的方法檢測了6種Bt殺蟲蛋白(Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C、Cry1B、Cry1Fa和Cry2A)對家蠶的毒性。GAB-3由浙江大學(xué)研發(fā)，目前正在申請生產(chǎn)性試驗中，它同時表達Cry1Ab和Cry2Ab兩種殺蟲蛋白。前期研究發(fā)現(xiàn)，GAB-3各組織中殺蟲蛋白表達量很高，殺蟲效果很好，因此評價這一轉(zhuǎn)基因玉米品系對家蠶的安全性具有代表性的意義。

1 材料與方法

1.1 供試Bt玉米花粉

轉(zhuǎn)cry1Ab和cry2Ab基因玉米GAB-3種子及其對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩追N子均由浙江大學(xué)提供。2019年4月將供試玉米種子種植于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院轉(zhuǎn)基因植物試驗基地，進行常規(guī)播種方式和栽培管理，全生育期不噴撒殺蟲劑。散粉期將玉米雄穗套袋，分別收集GAB-3和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩谆ǚ?，室溫干?4 h后過200目篩，移入塑料離心管中，密封后置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 供試Bt蛋白

測試用Bt蛋白Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C、Cry1B、Cry2Aa和Cry1Fa購自EnviroLogix Inc.(Portland，ME，USA)，將Bt蛋白溶解后并稀釋為實驗所需的濃度。

1.3 供試?yán)ハx

供試家蠶品種為秋風(fēng)×白玉，由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所提供蠶卵，在人工氣候培養(yǎng)箱中孵化，孵化后幼蟲置于溫度(27±1)℃，濕度80%±5%，光周期為16 h(L)/8 h(D)的培養(yǎng)箱中進行測試。

1.4 花粉蛋白檢測

采用ELISA方法檢測轉(zhuǎn)基因玉米GAB-3花粉中殺蟲蛋白含量。采用美國ENVIROLOGIX公司Cry1Ab/Cry1Ac和Cry2A檢測試劑盒檢測。采用酶標(biāo)儀(美國伯樂680酶標(biāo)儀)讀板，測定450 nm處吸光值。

1.5 生物測試

1.5.1 抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米GAB-3花粉對家蠶的影響

將試驗用花粉配制為以下5個濃度：0、0.1、0.5、1和5 mg·mL-1，取300 μL的溶液用毛刷涂抹于直徑5 cm的桑葉圓片，對應(yīng)花粉分布密度為0、10、50、100和500?！m-2，自然晾干后，在體視顯微鏡下檢查葉片上的實際花粉密度。每處理放置20頭蟻蠶，重復(fù)3次。每天觀察并記錄各處理家蠶存活情況并更換葉片，毛筆輕觸幼蟲不能爬行則視為死亡，記錄后即時清理。在試驗7、14和21 d對家蠶進行稱量，并記錄家蠶從孵化到結(jié)繭化蛹的發(fā)育歷期。結(jié)繭后，統(tǒng)計家蠶化蛹率、蛹重、繭重、繭殼重等指標(biāo)。

1.5.2 Bt蛋白對家蠶的影響

將待測試的6種Cry蛋白分別溶解后和飼料混勻，Cry1Fa、Cry1B和 Cry1C設(shè)置濃度為：0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8和1.6 μg·g-1；Cry2Aa設(shè)置濃度為：0、0.1、1、2、4和8 μg·g-1；Cry1Ab和Cry1Ac設(shè)置濃度為：0、0.1、1、10和100 μg·g-1。采用摻有不同濃度Cry蛋白的飼料飼養(yǎng)家蠶初孵幼蟲，接入初孵蟻蠶，每天更換新鮮飼料并將剩余飼料去除干凈，每個濃度梯度處理6頭，重復(fù)5次。試驗期間每天觀察記錄試蟲死亡個體數(shù)，并及時移出死亡個體，試驗結(jié)束后，對存活的幼蟲稱重并記錄，計算不同Cry蛋白對家蠶的半致死劑量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行整理和分析，采用Tukey HSD對家蠶的平均體重、幼蟲發(fā)育歷期、繭重、繭殼重和蛹重等進行多重比較，幼蟲的存活率和化蛹率進行百分?jǐn)?shù)反正弦轉(zhuǎn)換后再進行單因素方差分析，通過概率單位法(Probit analysis)求得GAB-3花粉和Cry蛋白對家蠶的半致死濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 GAB-3花粉中Cry蛋白含量

取試驗用GAB-3花粉，分別檢測Cry1Ab和Cry2Ab蛋白含量，測得轉(zhuǎn)基因玉米GAB-3花粉中Cry1Ab含量為(5.54±0.80) μg·g-1，Cry2Ab蛋白為(16.87±2.19) μg·g-1。

2.2 花粉在桑葉上的分布情況檢測

將制備好的桑葉放在體視鏡下觀察，檢測花粉的分布密度，結(jié)果顯示，桑葉上花粉的密度隨花粉懸濁液濃度的增加而增加。采用0.1、0.5、1和5 mg·mL-1的花粉懸濁液涂抹桑葉，花粉在桑葉上的實際分布密度分別為12.5、50.52、112.16和519.12?！m-2，接近預(yù)期密度。

不同數(shù)據(jù)間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。The bars with different lowercase letters showed significant difference(P<0.05).圖1 不同濃度花粉懸濁液處理的桑葉上花粉分布密度Fig.1 Maize pollen distribution on mulberry leaves with different pollen suspension treatment

2.3 轉(zhuǎn)基因玉米花粉對家蠶生長發(fā)育的影響

2.3.1 轉(zhuǎn)基因玉米花粉對家蠶幼蟲存活率和體重的影響

對處理不同時間的家蠶的存活率統(tǒng)計分析顯示，轉(zhuǎn)基因玉米GAB-3花粉在桑葉上的分布密度越大，喂食的時間越長，對家蠶的存活率影響越大(表1)。與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ仗幚斫M相比，GAB-3花粉在桑葉上分布密度為10和50?！m-2時對家蠶21 d存活率無顯著影響[ANOVA：10粒·cm-2，F(xiàn)=0.000，自由度(df)=1，P=1.000>0.05；50?！m-2，F(xiàn)=6.888，df=1，P=0.059>0.05]；GAB-3花粉分布密度達到100?！m-2時，家蠶14 d存活率顯著下降為(66.67±5.77)%，但對家蠶7 d存活率無顯著影響(ANOVA：7 d，F(xiàn)=3.623，df=1，P=0.130>0.05；14 d，F(xiàn)=307.954，df=1，P=0.000<0.05)。轉(zhuǎn)基因玉米花粉分布密度為500?！m-2時，家蠶7 d存活率只有(25.00±8.66)%，14 d存活率為0，遠(yuǎn)低于對照(ANOVA：7 d，F(xiàn)=300.783，df=1，P<0.05；14 d，P<0.05)。

表1 不同密度花粉處理家蠶的存活率和幼蟲體重Table 1 Survival rate and weight of Bombyx mori larvae fed with maize pollen of different density

對處理不同時間的家蠶的體重統(tǒng)計分析顯示，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，以GAB-3花粉密度為10粒·cm-2的桑葉喂食家蠶7 d，對其體重?zé)o顯著影響(ANOVA：F=0.938，df=1，P=0.388>0.05)，喂食14天后，其體重則顯著低于對照組(ANOVA：F=22.333，df=1，P=0.009<0.05)。以GAB-3花粉密度為50?！m-2以上的桑葉喂食家蠶7 d，其體重顯著低于對照組(ANOVA：F=127.768，df=1，P<0.05)。轉(zhuǎn)基因玉米GAB-3花粉密度越高，家蠶體重的增長越少。與無花粉對照組相比，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩谆ǚ厶幚沓^14 d對家蠶的體重也有顯著影響(ANOVA：10粒·cm-2，F(xiàn)=46.432，df=1，P=0.002<0.05；50?！m-2，F(xiàn)=46.838，df=1，P=0.002<0.05；100?！m-2，F(xiàn)=84.687，df=1，P=0.001<0.05；500?！m-2，F(xiàn)=897.701，df=1，P<0.05)，處理時間越長，體重差異越大。

2.3.2 轉(zhuǎn)基因玉米花粉對家蠶發(fā)育歷期、化蛹率、繭重、繭殼重和蛹重的影響

500粒·cm-2GAB-3花粉處理組家蠶在一至二齡全部死亡，所以不統(tǒng)計發(fā)育歷期。與無花粉對照組相比，不同濃度的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因花粉處理均顯著延長了家蠶幼蟲的發(fā)育歷期，并且花粉密度越高，家蠶的發(fā)育歷期越長，與相同濃度的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ栈ǚ厶幚斫M相比，GAB-3花粉處理對家蠶發(fā)育歷期有顯著影響(ANOVA：10粒·cm-2，F(xiàn)=12.437，df=1，P=0.024<0.05；50?！m-2，F(xiàn)=27.692，df=1，P=0.006<0.05；100?！m-2，F(xiàn)=571.322，df=1，P=0.000<0.05)。100?！m-2以下GAB-3花粉處理組家蠶均100%化蛹，各濃度GAB-3和非轉(zhuǎn)基因花粉處理組家蠶的繭重、繭殼重和蛹重均顯著低于無花粉處理組，但GAB-3處理組與對應(yīng)濃度的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ仗幚斫M間無顯著差異(ANOVA：繭重：10粒·cm-2，F(xiàn)=1.453，df=1，P=0.294>0.05；50粒·cm-2，F(xiàn)=0.715，df=1，P=0.445>0.05；100粒·cm-2，F(xiàn)=0.003，df=1，P=0.959>0.05。繭殼重：10粒·cm-2，F(xiàn)=0.025，df=1，P=0.883>0.05；50?！m-2，F(xiàn)=3.168，df=1，P=0.150>0.05；100粒·cm-2，F(xiàn)=5.752，df=1，P=0.074>0.05；蛹重：10粒·cm-2，F(xiàn)=1.772，df=1，P=0.254>0.05；50?！m-2，F(xiàn)=1.135，df=1，P=0.347>0.05；100粒·cm-2，F(xiàn)=0.076，df=1，P=0.796>0.05)。

表2 不同密度花粉處理家蠶的生理指標(biāo)參數(shù)表Table 2 Life table parameters of Bombyx mori larvae fed with maize pollen of different density

2.3.3 轉(zhuǎn)基因玉米GAB-3花粉對家蠶的半致死濃度

根據(jù)GAB-3花粉飼喂7、14和21 d家蠶的死亡情況，計算GAB-3花粉飼喂家蠶不同時間的LC50，結(jié)果如表3所示，7 d的半致死濃度最高，為261.18?！m-2，14 d為122.86?！m-2，21 d為112.38粒·cm-2。

表3 轉(zhuǎn)基因玉米GAB-3花粉對家蠶幼蟲的致死效應(yīng)Table 3 Lethal effect of GAB-3 pollen against Bombyx mori larvae

2.4 Cry蛋白對家蠶生長發(fā)育的影響

2.4.1 Cry蛋白對家蠶幼蟲存活率的影響

分別將不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Cry1C、Cry1Fa、Cry1B、Cry2Aa、Cry1Ab和Cry1Ac蛋白摻入飼料中測試6種Cry蛋白對家蠶的影響。結(jié)果顯示，家蠶對不同的Cry蛋白敏感性有顯著差異，對Cry1Ac和Cry1Ab最不敏感，飼料中摻入高達100 μg·g-1的Cry1Ac蛋白對家蠶的7 d存活率無顯著影響，其次為Cry1Ab，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達100 μg·g-1時，家蠶7 d存活率仍接近80%；毒性最強的是Cry1C和Cry1Fa，飼料中摻入質(zhì)量分?jǐn)?shù)達0.8 μg·g-1時，家蠶即全部死亡，Cry1B和Cry2Aa的毒性中等，Cry1B質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.6 μg·g-1時，家蠶全部死亡，Cry2Aa質(zhì)量分?jǐn)?shù)達4 μg·g-1時，家蠶的存活率降到23.33%(圖2)。

圖2 六種Cry蛋白對家蠶幼蟲存活率的影響Fig.2 Survival rate of neonate larvae exposed to Cry1C，Cry1Fa，Cry1B，Cry2Aa，Cry1Ab and Cry1Ac for 7 days

2.4.2 Cry蛋白對家蠶體重的影響

家蠶取食幾種Cry蛋白后體重多明顯下降，且處理濃度越高，下降越為明顯(ANOVA：Cry1C，F(xiàn)=74.194；df=6；P<0.05；Cry1Fa，F(xiàn)=57.721；df=6；P<0.05；Cry1B，F(xiàn)=30.702；df=6；P<0.05；Cry2Aa，F(xiàn)=115.948；df=5；P<0.05；Cry1Ab，F(xiàn)=34.430；df=4；P<0.05；Cry1Ac：，F(xiàn)=56.913；df=4；P<0.05)。Cry1C、Cry1Fa和Cry1B蛋白達到一定濃度時，對家蠶有較為明顯的致死效應(yīng)，在較低濃度時對家蠶體重也有顯著的影響，當(dāng)飼料中Cry1C濃度達0.05 μg·g-1，Cry1Fa濃度達0.1 μg·g-1，Cry1B濃度達0.8 μg·g-1時即對家蠶的體重有顯著的影響；Cry2Aa濃度達1 μg·g-1時對家蠶體重有顯著的影響，Cry1Ab在達10 μg·g-1時，Cry1Ac在達1 μg·g-1時對家蠶體重有顯著影響(表4)。

表4 飼喂家蠶幼蟲Cry蛋白7 d體重Table 4 The weight of larvae exposed to Cry1C，Cry1Fa，Cry1B，Cry1Ab，Cry1Ac and Cry2Aa for 7 days

2.4.3 Cry蛋白對家蠶幼蟲的半致死效應(yīng)

6種Cry蛋白對家蠶的7 d半致死濃度見表5。結(jié)果顯示，家蠶對Cry1C和Cry1Fa最為敏感，LC50均為0.39 μg·g-1，Cry1B的LC50為1.04 μg·g-1，Cry2Aa的LC50為2.89 μg·g-1。Cry1Ab的LC50為6 333.99 μg·g-1，Cry1Ac各試驗濃度間死亡率無顯著差異，未獲得半致死劑量。家蠶對6種Bt蛋白的敏感程度為Cry1C>Cry1Fa>Cry1B>Cry2Aa>Cry1Ab>Cry1Ac。

表5 Cry蛋白對家蠶幼蟲的半致死效應(yīng)Table 5 Lethal effect of 6 Cry proteins against Bombyx mori larvae

3 討論

在轉(zhuǎn)基因植物表達的外源殺蟲蛋白對非靶標(biāo)生物的環(huán)境安全評價相關(guān)試驗中，受試殺蟲蛋白劑量的選擇通常要考察自然條件下的暴露量。家蠶接觸殺蟲蛋白的途徑主要通過轉(zhuǎn)基因植物花粉漂移到桑葉的途徑，因此桑葉上花粉的分布密度是評價轉(zhuǎn)基因抗蟲植物對家蠶可能造成的影響首先考慮的要素。受氣候條件、地形等各種因素的影響，花粉漂移的距離有很大的差異。對緊鄰稻田的桑樹上水稻花粉的分布數(shù)量調(diào)查結(jié)果顯示，10 m范圍內(nèi)桑葉上花粉平均分布密度為92.9粒·cm-2[10]。與水稻相比，玉米花粉大而且重，在一般的氣象條件下，大部分的玉米花粉會沉積在20～40 m的范圍內(nèi)[11]。目前沒有玉米花粉在桑葉上的沉積數(shù)量的調(diào)查，但關(guān)于玉米花粉在蕁麻上的沉積數(shù)量調(diào)查顯示，緊鄰玉米地時花粉密度達100?！m-2，超過10 m時下降到10?！m-2以下[12]。Bt玉米花粉向馬利筋葉片(Asclepiassyriaca)上自然飄落的調(diào)查結(jié)果顯示，距離玉米地邊緣為2 m時，花粉密度降到14.2?！m-2[13]。與蕁麻和馬利筋相比，桑樹更高，桑葉表面也更光滑，前排的樹木會形成遮擋，阻止花粉向后排樹上漂移，并且在飼喂幼蠶時采集的桑葉為位于頂端的幼嫩桑葉，有時需要清洗消毒，這些都會大大降低家蠶平均攝取到的花粉數(shù)量?？瓜x蛋白在轉(zhuǎn)基因植物花粉中的表達水平是另一個影響暴露量的因素。不同的轉(zhuǎn)化體由于采用的啟動子不同或遺傳背景等方面的差異，其外源蛋白的表達水平在不同組織和器官間存在很大的差異，如轉(zhuǎn)基因玉米MON810花粉中Cry1Ab的含量為Bt176的1/40[6]。Yao等[14]報道家蠶對Bt水稻B1(Cry1Ab)和KMD1(Cry1Ab)的花粉敏感，對TT9-3(Cry1Ab/Cry1Ac)不敏感，認(rèn)為其中一個重要原因是花粉中蛋白表達量的差異。GAB-3中Cry1Ab和Cry2Ab基因采用的啟動子分別為ZmUbi-1和Actin-1，Bt蛋白在各組織中均有表達，我們檢測發(fā)現(xiàn)Cry1Ab和Cry2Ab在花粉中的表達量分別達到了(5.54±0.80) μg·g-1和(16.87±2.19)μg·g-1，Cry1Ab的表達水平接近Bt176(1.1～5.0 μg·g-1)，遠(yuǎn)高于MON810(<0.09 μg·g-1)[6]。

暴露時間的選擇是評價轉(zhuǎn)抗蟲基因植物對非靶標(biāo)生物影響的另一個要素。本試驗發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因玉米花粉密度為10和50?！m-2時對家蠶21 d存活率無顯著影響，100?！m-2的處理對家蠶7 d的存活率無顯著影響，14 d的半致死劑量不到7 d的一半，這顯示評價轉(zhuǎn)基因玉米對家蠶的安全性試驗中接觸時間的長短有很大的影響，短時間高劑量的暴露并不會對家蠶產(chǎn)生較大的影響，在轉(zhuǎn)基因水稻上也有類似報道[3-4]。玉米散粉盛期為不到一周的時間，即使剛好在這段時間飼養(yǎng)幼蠶，其接觸花粉的時間一般不會超過1周，因此1周或更短的暴露時間更能反映真實的情況。本試驗結(jié)果表明，與對照組相比，高于50?！m-2GAB-3的花粉處理對家蠶的體重有顯著影響，但是與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ栈ǚ厶幚斫M相比，GAB-3花粉處理組的繭重、繭殼重和蛹重并無顯著差異。同時發(fā)現(xiàn)非轉(zhuǎn)基因玉米的花粉對家蠶的發(fā)育歷期和體重也有顯著的影響，這可能是由于當(dāng)桑葉表面附有花粉時，家蠶會出現(xiàn)進食下降，從而造成同時期取食有花粉桑葉的家蠶體重低于無花粉對照組。

轉(zhuǎn)基因玉米中表達的Bt蛋白類型對家蠶的安全性有顯著的影響。本試驗顯示，家蠶對不同的Bt蛋白敏感性差異非常大，其中Cry1Ab是轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米中使用最廣泛的Bt蛋白，家蠶對其敏感性較低，這可能也是許多表達Cry1Ab或Cry1Ac蛋白的轉(zhuǎn)基因植物花粉對家蠶生長發(fā)育無顯著影響的原因[2-3，5]。Cry1B和Cry2A在測試的6種Bt蛋白中對家蠶的毒性中等，Cry1B在目前商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因玉米中未見使用，Cry1C和Cry1Fa對家蠶毒性最高，二者也均有在轉(zhuǎn)基因玉米中獲得應(yīng)用，表達這2種殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米花粉可能會對家蠶有較高的毒性，但要結(jié)合蛋白在花粉中的表達水平進行判斷。目前我國接近商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因玉米中采用的Bt殺蟲蛋白主要為Cry1Ab，其對家蠶的毒性較低。GAB-3中同時表達低毒性的Cry1Ab和中毒性的Cry2A兩種殺蟲蛋白，一定程度上增加了其花粉對家蠶的毒性，但短時間較低密度花粉的暴露對家蠶的存活和生長發(fā)育未造成顯著影響。在實際生產(chǎn)中，家蠶接觸到的轉(zhuǎn)基因玉米花粉密度較低，暴露時間也比較短。因此，認(rèn)為轉(zhuǎn)Cry抗蟲基因玉米對家蠶的風(fēng)險較低。