王應(yīng)蘭，姜 雄，吉 俐，張景寧，謝承衛(wèi)

(貴州大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

我國的煤炭開采量和消費量在世界上都穩(wěn)居首位[1]。煤矸石是在煤炭開采和洗選加工過程中產(chǎn)生的一種煤炭伴生礦物，但由于長久以來都沒有得到有效的利用，因而成為我國排放量和堆積量最大的工業(yè)固體廢棄物之一[2-5]。由于煤矸石堆積，大量土地資源被占用，而且煤矸石的大量堆積還會產(chǎn)生潰壩的風(fēng)險；在堆放中，煤矸石還可能會發(fā)生自燃，從而產(chǎn)生SO2、NOx等有害氣體。目前，煤矸石的利用主要集中在發(fā)電、建材生產(chǎn)、填埋、道路建設(shè)和采空區(qū)充填等方面[6-8]，利用方式簡單，效率不高，并沒有充分利用煤矸石中的相關(guān)成分。煤矸石中的有機(jī)質(zhì)含量通常為15%～25%，且富含氮、磷、鉀、鈣和植物生長所需的其他元素，因此可用作制備微生物肥料的原料[9-11]。

研究發(fā)現(xiàn)，許多微生物都具有解磷能力，水、土壤、堆肥，以及植物體表廣泛分布著解磷微生物[12-15]。在土壤微生物中，0.1%～0.5%的真菌、1%～50%的細(xì)菌和10%～50%的放線菌具有解磷能力[14，16]；因此，相對于解磷真菌，具有解磷能力的細(xì)菌和放線菌更易獲得。解磷細(xì)菌能夠?qū)⑼寥乐幸呀?jīng)固化的磷和難溶的磷重新轉(zhuǎn)化為可溶性磷，以供植物生長[17]。

近年來，有關(guān)利用解磷菌制備微生物肥料的研究逐漸增多。吳文麗等[18]將3株解磷細(xì)菌混合發(fā)酵，并將其與雞糞按1∶9的比例混勻，按2 000∶1、20 000∶1的比例分別添加葡萄糖和尿素，制成解磷菌肥。劉灝等[19]以啤酒廢水為基質(zhì)，加入解磷菌進(jìn)一步發(fā)酵制備解磷菌肥。也有研究利用解磷細(xì)菌來處理低品位磷礦，轉(zhuǎn)化磷礦中的難溶性磷[20-22]。但是，鮮有利用解磷菌處理煤矸石制備肥料的報道。為此，本研究擬利用解磷菌處理煤矸石制備肥料，以期為相關(guān)研究提供借鑒與參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

HH.S11-4型恒溫水浴箱，北京長安科學(xué)儀器廠；DHG-9053AS型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海經(jīng)濟(jì)區(qū)沈蕩中新電器廠；AMA440N型全自動高壓滅菌鍋，美國Astell；PYX-DHS型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療機(jī)械廠；BK5000型生物顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司；TGL-20M型臺式高速冷凍離心機(jī)，長沙高新開發(fā)區(qū)湘儀貝克儀器儀表有限公司；TC-412型PCR儀，英國Techne；YCP-33A型電泳槽，北京六一儀器廠；Syngene凝膠成像系統(tǒng)，英國Syngene；UV2000型紫外可見分光光度計，尤尼柯上海儀器有限公司；6400A型火焰光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；JB-3型定時恒溫磁力攪拌器，上海雷磁新涇儀器有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

難溶性無機(jī)磷固體培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，(NH4)SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·H2O 0.03 g，Ca3(PO4)210 g，15～20 g瓊脂，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.2。

LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，氯化鈉5 g，牛肉膏1 g，酵母膏2 g，15～20 g瓊脂，蒸餾水1 000 mL，pH值7.4。

1.1.3 菌種來源

GZU-Mic02菌株分離自貴州某煤炭產(chǎn)區(qū)的風(fēng)化煤矸石樣品，巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium，菌株保藏編號ACCC1011)購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌株保藏中心。

1.1.4 煤矸石

煤矸石樣品來自于貴州某煤矸石山的低硫煤矸石。將煤矸石過20目(粒徑830 μm)篩，經(jīng)檢測，其營養(yǎng)元素含量如下：全氮3.67 g·kg-1，全磷1.10 g·kg-1，全鉀3.12 g·kg-1，全硫20.75 g·kg-1，有機(jī)質(zhì)371.5 g·kg-1，有效磷7.44 mg·kg-1，有效鉀0.11 g·kg-1，pH值7.5。

1.1.5 煙草

供試煙草品種為云煙87。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定

將細(xì)菌接種于LB固體培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，染色后在顯微鏡下進(jìn)行觀察。

GZU-Mic02菌株的一系列生理生化試驗，包括葡萄糖、乳糖和甘露糖的分解，明膠液化試驗，半固體瓊脂動力試驗，以及精氨酸雙水解試驗等按照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[23]進(jìn)行。

提取GZU-Mic02菌株的總DNA，并將其通過引物進(jìn)行菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，所使用的通用引物為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT)[24]。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共30個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min；4 ℃終止反應(yīng)。由上海立菲生物技術(shù)有限公司對獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。使用BLAST程序在NCBI數(shù)據(jù)庫中分析基因序列，并使用Mega 5.05軟件基于鄰接法構(gòu)建GZU-Mic02菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.2 菌株解磷效果的正交試驗

課題組前期就煤矸石粒徑、體系pH值、接菌量、培養(yǎng)時間、體系干濕程度、培養(yǎng)溫度，以及振蕩或靜置培養(yǎng)這些因素對細(xì)菌解離煤矸石的影響程度進(jìn)行了探究，根據(jù)單因素試驗結(jié)果確定選取粒徑、pH值、接菌量和培養(yǎng)時間作為正交試驗的因素，分別設(shè)計GZU-Mic02菌株和巨大芽孢桿菌的L9(34)正交試驗，各組試驗處理煤矸石的量均為20 g。

GZU-Mic02菌株進(jìn)行試驗時：粒度的1～3水平分別設(shè)置為20目(840 μm)、100目(150 μm)、160目(96 μm)，pH值的1～3水平分別設(shè)置為5.5、6.0、6.5，接菌量的1～3水平分別設(shè)置為80、90、100 mL，培養(yǎng)時間的1～3水平分別設(shè)置為4、5、6 d。用巨大芽孢桿菌進(jìn)行試驗時：粒度的1～3水平分別設(shè)置為20目、100目、160目，pH值的1～3水平分別設(shè)置為7.5、8.0、8.5，接菌量的1～3水平分別設(shè)置為80、90、100 mL，培養(yǎng)時間的1～3水平分別設(shè)置為2、3、4 d。

1.2.3 煤矸石肥料的制備

根據(jù)正交試驗結(jié)果得到菌株處理煤矸石的最優(yōu)組合，并依其制備煤矸石肥料。將GZU-Mic02菌株和巨大芽孢桿菌接種于LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)至對數(shù)期末期，然后在培養(yǎng)基中加入適量無菌生理鹽水將細(xì)菌沖洗下來制成菌液，GZU-Mic02菌株的菌液濃度控制在(1.02～1.50)×1010CFU·mL-1，巨大芽孢桿菌的菌液濃度控制在(1.15～1.57)×1010CFU·mL-1。按照最優(yōu)組合，將菌液與20 g煤矸石混勻，并用1 mol·L-1HCl或NaOH調(diào)節(jié)體系pH值，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至相應(yīng)的時間，取出后晾干。

1.2.4 煤矸石肥料和土壤成分的測定

煤矸石肥料和土壤中的堿解氮、有效磷、速效鉀、交換性鈣含量，以及土壤磷吸收系數(shù)按照《土壤分析技術(shù)規(guī)范》[25]進(jìn)行測定。

1.2.5 煤矸石肥料應(yīng)用試驗

用制備的煤矸石肥料進(jìn)行盆栽試驗。所使用的土壤取自于荒廢菜地，供試植株為煙草。將制備的煤矸石肥料作為基肥一次性混入土壤中(每盆約500 cm3土壤中混入25 g煤矸石肥料)，再將煙苗移栽至土壤中。添加用GZU-Mic02菌株制備的煤矸石肥料的標(biāo)為T1處理，添加用巨大芽孢桿菌制備的煤矸石肥料的標(biāo)為T2處理，各設(shè)5個平行試驗組，另設(shè)置不添加煤矸石肥料的對照處理(CK)。將移栽好的煙草盆栽在溫室中培育25 d，記錄培育前后煙草的生長情況，及土壤中堿解氮、有效磷、速效鉀、交換性鈣含量和土壤磷吸收系數(shù)的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1 菌落形態(tài)和顯微形態(tài)

GZU-Mic02菌株在LB固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和菌體形態(tài)如圖1所示?？梢钥闯?，GZU-Mic02是一株不透明、黃色、形狀規(guī)則、邊緣整齊、表面濕潤有光澤的革蘭氏陽性球菌，其單菌落大小約1 mm，在1 000倍顯微鏡下，菌體成雙疊、四疊或八疊，無莢膜、鞭毛和芽孢。

圖1 GZU-Mic02的菌落形態(tài)(A)和菌體形態(tài)(B)Fig.1 Colony characteristic (A) and microscopic characteristic (B) of GZU-Mic02

2.1.2 生理生化鑒定

將GZU-Mic02菌株分別接種于葡萄糖、硝酸鹽還原、甘露醇、甘露糖、乳糖、明膠、膽汁七葉苷、精氨酸雙水解、半固體瓊脂微量生化管中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h(明膠微量生化管培養(yǎng)48 h)；氧化酶試驗采用氧化酶試紙和試液進(jìn)行，接觸酶試驗用3%(體積分?jǐn)?shù))H2O2溶液進(jìn)行。結(jié)果如表1所示：GZU-Mic02菌株為接觸酶和氧化酶陽性，不分解葡萄糖、乳糖、明膠、膽汁七葉苷，精氨酸雙水解、甘露糖、甘露醇和硝酸鹽還原試驗均為陰性，不具有運動性，其生理特性與藤黃微球菌(Micrococcusluteus)標(biāo)準(zhǔn)菌株基本相符。

表1 GZU-Mic02菌株與藤黃微球菌(Micrococcus luteus)標(biāo)準(zhǔn)菌株的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of GZU-Mic02 and type strain of Micrococcus luteus

2.1.3 GZU-Mic02菌株的16S rRNA鑒定

系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)顯示，GZU-Mic02菌株與Micrococcusluteusstrain WBZ(KC460989)在同一分枝上，親緣關(guān)系最近。而且，BLAST比對結(jié)果顯示，2株細(xì)菌的同源性達(dá)100%。綜上，將GZU-Mic02菌株鑒定為藤黃微球菌。

圖2 GZU-Mic02菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of GZU-Mic02 strain based on 16S rRNA sequences

2.2 巨大芽孢桿菌和GZU-Mic02菌株解離煤矸石的正交試驗結(jié)果

在GZU-Mic02菌株和巨大芽孢桿菌解離煤矸石的過程中，細(xì)菌的活性在很大程度上限定了解磷的效果。這2株菌均為好氧細(xì)菌，當(dāng)煤矸石粒徑較大時，體系中的溶氧量適宜，細(xì)菌活性較好；而當(dāng)煤矸石粒徑較小時，體系中的溶氧量降低，細(xì)菌活性降低。由于體系中除煤矸石外未添加其他碳源，因此，當(dāng)接菌量過大時，可供細(xì)菌生存所需的碳源相對不足，細(xì)菌活性也隨之下降。此外，每種細(xì)菌都有其適宜生存的pH值和生長周期，過酸或過堿的環(huán)境均會影響其活性，且培養(yǎng)時間過長、細(xì)菌進(jìn)入衰亡期后，細(xì)菌活性和體系活菌數(shù)均降低，解磷效果亦隨之降低。因此，應(yīng)選擇適宜的煤矸石的粒徑、體系pH值、接菌量和培養(yǎng)時間來制備煤矸石肥料。

用GZU-Mic02菌株和巨大芽孢桿菌解離煤矸石的正交試驗結(jié)果分別如表2和表3所示。經(jīng)分析，GZU-Mic02菌株解離煤矸石的最佳條件為：煤矸石粒徑20目，體系pH值5.5，接菌量100 mL，培養(yǎng)時間6 d。巨大芽孢桿菌解離煤矸石的最佳條件為：煤矸石粒徑20目，體系pH值8.5，接菌量80 mL，培養(yǎng)時間4 d。

表3 巨大芽孢桿菌的正交試驗結(jié)果Table 3 Orthogonal experiment results of B.megaterium

表2 GZU-Mic02菌株的正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment results of GZU-Mic02

根據(jù)正交試驗得到的最佳條件，分別用GZU-Mic02菌株和巨大芽孢桿菌制備煤矸石肥料，其堿解氮、有效磷、速效鉀和交換性鈣的含量如表4所示。可以看出，用GZU-Mic02菌株和巨大芽孢桿菌制備的煤矸石肥料與煤矸石相比，具有更高的堿解氮、有效磷和速效鉀含量，用GZU-Mic02菌株制備的煤矸石肥料比用巨大芽孢桿菌制備的煤矸石肥料有更高的堿解氮和有效磷含量，而用巨大芽孢桿菌制備的煤矸石肥料中的速效鉀相含量比用GZU-Mic02菌株制備的煤矸石肥料要高一些。制備的煤矸石肥料中的交換性鈣含量都比煤矸石要低，這是因為菌株在解磷的過程中會吸收鈣離子。

表4 煤矸石和煤矸石肥料的成分Table 4 Composition of coal gangue and coal gangue fertilizers mg·kg-1

2.3 煤矸石肥料對煙草植株和植煙土壤的影響

從表5煙草培育過程中莖圍、株高和葉片大小的生長變化情況可知，制備的煤矸石肥料對煙草生長均有促進(jìn)作用，其中，用GZU-Mic02菌株制備的煤矸石肥料的促進(jìn)作用要優(yōu)于用巨大芽孢桿菌制備的煤矸石肥料。

表5 煙草培育過程中不同處理各長勢指標(biāo)的變化Table 5 Dynamic of tobacco growth indicators under different treatments

以未培育煙草且不施肥的土壤作為空白處理(T0)，對比T0、T1、T2和CK處理的土壤堿解氮、有效磷、速效鉀、交換性鈣含量和磷吸收系數(shù)，結(jié)果如表6所示。各處理中，空白處理的土壤堿解氮、有效磷、交換性鈣含量和磷吸收系數(shù)最低，且顯著(P<0.05)低于其他處理。與對照處理相比，施用制備的煤矸石肥料后，土壤的堿解氮、有效磷、速效鉀含量和磷吸收系數(shù)均顯著(P<0.05)升高。

表6 土壤的理化性質(zhì)變化Table 6 Change of physical and chemical properties of soil

3 結(jié)論

本試驗從風(fēng)化的煤矸石中分離篩選出一株解磷菌GZU-Mic02，經(jīng)過鑒定，該菌株為藤黃微球菌，且其解磷能力優(yōu)于巨大芽孢桿菌。采用巨大芽孢桿菌和GZU-Mic02菌株解離煤矸石制備肥料，制備的煤矸石肥料對煙苗均有一定的促生作用，且以用GZU-Mic02菌株制備的煤矸石肥料的促生作用更佳。另外，制備的煤矸石肥料均會顯著提高煙苗根際土壤中的堿解氮、有效磷、速效鉀含量。

本研究說明，利用解磷菌解離煤矸石制備肥料是一種可行的煤矸石資源化利用的方式。目前，該方法仍停留在實驗室階段，若將其投入生產(chǎn)應(yīng)用中，能在一定程度上緩解煤矸石大量堆積給環(huán)境帶來的壓力。