宮頸鱗癌患者單一人乳頭瘤病毒感染型別分布及發(fā)病年齡的研究

陳 曄，黃 健，耿建祥，蔡 博，李淑鋒，顧冬梅，仇 瑋，候進軍,趙 雪

0 引 言

宮頸癌是一種危害我國女性身心健康的主要婦科惡性腫瘤。宮頸癌組織學診斷類型主要有宮頸鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)和宮頸腺癌(adenocarcinoma,ADC)，以及其他少見的宮頸腺鱗癌、宮頸小細胞癌和宮頸未分化癌等。其中宮頸鱗癌約占80%～85%，宮頸腺癌約占10%～15%[1-4]。近年來，我國宮頸癌的發(fā)病率呈現(xiàn)出上升且年輕化的趨勢。我國國家癌癥中心2019年發(fā)表的數(shù)據顯示：2015年我國宮頸癌新增病例約10萬人，死亡人數(shù)約3萬人[5]。宮頸鱗癌是目前病因明確的惡性腫瘤，高危型人乳頭瘤病毒(high-risk human papillomavirus, HR-HPV)持續(xù)性感染是其主要病因。因HPV感染率、感染型別以及各型別感染的年齡分布在不同的種族和不同的地域存在著差異性，以致HPV感染越來越引起人們的關注。為進一步分析以江蘇省為主的區(qū)域性宮頸鱗癌患者的單一HPV感染型別分布與發(fā)病年齡的狀況，本文回顧性分析851例單一HPV型別感染宮頸鱗癌患者的臨床病理資料，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析1978年11月至2019年6月江蘇省無錫市錫山人民醫(yī)院、安徽省安慶市第一人民醫(yī)院和第二人民醫(yī)院、安徽省當涂縣人民醫(yī)院、浙江省寧波市鄞州人民醫(yī)院、山東省臨沂市腫瘤醫(yī)院、河南省商城縣人民醫(yī)院、江蘇省南京市婦幼保健院、南京市六合區(qū)人民醫(yī)院和六合區(qū)中醫(yī)院、南京市大廠醫(yī)院、南京市中醫(yī)院、南京市江寧區(qū)人民醫(yī)院、南京市梅山醫(yī)院、鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院、鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)人民醫(yī)院、楊中市人民醫(yī)院、徐州市中醫(yī)院、徐州市婦幼保健院、新沂市人民醫(yī)院、邳州市人民醫(yī)院、射陽縣人民醫(yī)院、大豐市人民醫(yī)院、常熟市第一人民醫(yī)院、常熟市中醫(yī)院、金湖縣人民醫(yī)院、靖江市人民醫(yī)院、鹽城市第一人民醫(yī)院、興化市人民醫(yī)院、昆山市第一人民醫(yī)院、揚州市洪泉醫(yī)院、江蘇大學附屬醫(yī)院病理科的病理組織學診斷為宮頸鱗癌患者1125例資料，其中單一HPV型別感染者851例。851例患者中，年齡為23～90歲，平均(56.5±5.4)歲,其中20～29歲7例(0.82%)，30～39歲79例(9.28%)，40～49歲289例(33.96%)，50～59歲239例(28.09%)，60～69歲153例(17.98%)，70～79歲65例(7.64%)，80～89歲18例(2.12%)，90～99歲1例(0.12%)。

1.2 方法從宮頸鱗癌石蠟組織中提取HPV DNA，采用聚合酶鏈式反應與基因芯片檢測技術對患者的癌組織行23種HPV檢測。由1位病理科副主任醫(yī)師和1位主治醫(yī)師根據WHO(2003年)婦科腫瘤組織學的分類標準進行復片，并復習其臨床病理資料。

1.2.1 儀器與試劑PCR儀為美國Life Technology公司生產的ABI7500型，高速冷凍離心機為德國eppendorf公司生產的5810 R型，分子雜交儀為江蘇省興化市分析儀器廠生產的FYY-3型，-20 ℃冰箱由青島海爾有限公司生產。HPV基因分型檢測試劑盒由亞能生物技術(深圳)有限公司提供。顯色液須新鮮配制，使用時所需濃度加蒸餾水配制。

1.2.2 標本的采集先去除每例石蠟組織周邊多余的石蠟，將其石蠟組織切成4 μm厚的切片，切3～5片石蠟組織即可。用專用的鑷子輕輕夾取，放入小離心管中，切第2例石蠟組織前，用次氯酸鈉溶液擦刀片及鑷子各3次。

1.2.3 DNA的提取將切下的石蠟組織片放入1.5 mL離心管中，加入裂解液150 μL，充分振蕩混勻，放入金屬浴中加熱100 ℃ 10 min，立刻13 000 r/min離心10 min，離心半徑7 cm。取中間層DNA溶液待用。PCR擴增、雜交、孵育和顯色按說明書進行規(guī)范操作。每份標本顯色后，根據膜芯片上的各個型別位點雜交信號的有無，來判斷結果。低危型：6、11、42、43、81、83型，其他型別均為高危型。

1.3 觀察指標因我國從2009年開展對農村婦女宮頸癌的篩查工作，將農村婦女宮頸癌的篩查的年齡劃定在35～64歲的女性作為篩查對象，故以65歲為界分為2組進行比較各單一HPV感染型別檢出率，再進行各主要單一HPV型別年齡段分布(以10歲作為一個年齡段)之間的比較。

2 結 果

2.1 宮頸鱗癌患者HPV感染型別檢出率及<65歲和≥65歲者單一HPV感染型別檢出率比較1125例宮頸鱗癌患者中，單一HPV感染型別檢出率為75.64%(851/1125)，均為高危型HPV感染；多種HPV感染型別者185例(其中二型感染者146例，三型感染者30例，四型感染者3例，五型和六型感染者各2例，七型和九型感染者各1例)，多種型別檢出率為16.44%(185/1125)。單一HPV感染型別者中高危型HPV前8位依次是16型為69.80%(594/851)、18型為7.52%(64/851)、58型為5.99%(51/851)、52型為3.53%(30/851)、33型為3.41%(29/851)、31型為3.29%(28/851)、59型為2.35%(20/851)、45型為1.06%(9/851)。851例宮頸鱗癌患者的單一HPV感染型別2組年齡檢出人數(shù)及百分比見表1。

表1 851例宮頸鱗癌患者的單一HPV感染型別2組年齡檢出人數(shù)及百分比[n(%)]

2.2 宮頸鱗癌患者的前7位單一HPV感染型別的平均年齡及前8位不同年齡段單一HPV感染型別的分布狀況851例宮頸鱗癌患者的單一HPV感染型別前7位的平均年齡依次是：16型感染者為50.76歲，18型感染者為52.23歲，59型感染者為55.70歲，33型感染者為56.69歲，31型感染者為56.93歲，52型感染者為66.27歲，58型感染者為66.57歲。前8位單一HPV感染型別各年齡段分布百分比見表2。其他8種單一HPV感染型別共26例，分別為39型6例、51型5例、53型2例、56型2例、66型5例、68型2例、73型2例、82型2例。

表2 851例宮頸鱗癌患者的前8位不同年齡段單一HPV感染型別分布百分比(%)

2.3 宮頸鱗癌患者各單一HPV感染型別不同年齡段分布的比較宮頸鱗癌患者單一HPV感染型別在年齡段分布上的比較顯示，16型與52型、16型與58型、18型與52型、18型與58型、45型與52型、45型與58型這6組型別之間比較，在年齡段上差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示這5種單一HPV感染型別之間在年齡段的分布上明顯不同。宮頸鱗癌患者單一HPV感染型別在年齡段之間的比較：30～39歲和40～49歲分別與60～69歲、70～79歲和80～89歲比較，50～59歲和60～69歲與70～79歲和80～89歲比較，≤29歲與80～89歲比較，不同的HPV感染型別在年齡段分布上有明顯的差異性(P<0.05)，提示這11組年齡段之間比較，單一HPV感染型別分布有明顯不同。

3 討 論

宮頸癌的主要致病因素與HR-HPV的持續(xù)性感染密切相關，因此，HR-HPV檢測已成為宮頸癌篩查的一個主要手段。由于不同的HR-HPV型別致宮頸癌的風險度不一樣，其分布的年齡段及比例也不一樣。因此，弄清楚不同的HR-HPV型別的致癌風險排序以及不同年齡段的分布狀況，可為婦產科醫(yī)師提供臨床宮頸癌的防治策略。由于不同的HR-HPV型別致宮頸鱗癌的分型數(shù)據庫的建立都是以宮頸鱗癌組織標本檢出的分型結果作為評判標準的，因此，宮頸鱗癌的不同HR-HPV感染型別不同年齡段分布情況也應依據宮頸鱗癌組織的HPV分型檢測結果來進行分析。6、11、42、43、81、83型等低危型HPV一般不單獨出現(xiàn)在宮頸癌組織中，只是與HR-HPV以混合感染的方式存在于宮頸癌組織中，宮頸鱗癌的發(fā)生與16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82型等HR-HPV感染相關聯(lián)[3,6]。目前，致宮頸癌風險度最高的兩種HR-HPV型別分別是HPV16型和18型。由于不同的HR-HPV型別致宮頸鱗癌風險度以及年齡段分布不同，了解其規(guī)律有助于臨床醫(yī)師更好地對HPV感染患者的患癌風險進行個體化預判。因此，弄清楚主要的HR-HPV致癌風險度及不同年齡段分布狀況，對我國宮頸鱗癌的防治及HPV預防性疫苗的研制都具有循證醫(yī)學的意義。

從HPV的分類及生物學特征來分析單一HPV型別感染前7位宮頸鱗癌患者平均年齡，根據HPV的屬種分類原則，同一種的HPV型別之間會有一樣的或者相似的分子特點和致病屬性。a-PV屬第7種中有HPV的18、39、45、59、68、70型6個成員，占本文單一HPV感染型別前8種的3個型別，其中18型平均年齡52.23歲，比我國較常見的59型平均年齡55.70歲低3.47歲，提示18型致癌力不但排名第二位，平均年齡較低，是此組最強的型別，且易侵襲年齡偏小的女性；a-PV屬第9種中有HPV的16、31、33、35、52、58、67型7個成員，占本文單一HPV感染型別前8種的5個型別，其中16型平均年齡50.76歲，比18型平均年齡小1.47歲，也比我國常見的31、33、52和58型的平均年齡56.93歲、55.24歲、66.27歲和66.57歲小4.48～15.81歲。我國崔劍峰等[7]報道宮頸鱗癌的多中心的研究表明單一18型平均年齡為40.7歲，16型平均年齡為48.6歲，其他型別平均年齡為55.3歲。與本研究的宮頸鱗癌平均年齡比較，16型和18型平均年齡都較小，后者比前者平均年齡更年輕，且18型比16型平均年齡更小，與本研究的結果不一樣，這可能與兩研究所采用的檢測試劑，標本獲取的地域、時間及數(shù)量不同有關。

婦產科醫(yī)師在臨床工作中要把a-PV屬第7種和第9種中的HPV各型別作為關注的重點，其中16型是本研究中常見7個型別中致癌力排名第一位，平均年齡最低，是2組中致癌力最強的型別，且最易侵襲年齡較小的女性。因此，婦產科醫(yī)師首先要對宮頸病變的患者行HPV分型檢測，接著確定此患者為持續(xù)性感染者后來評估不同HR-HPV感染型別的年齡風險度，對16型感染的患者從23～88歲年齡段的都應該給予關注，重點是40～49歲、50～59歲兩個高發(fā)病年齡段的患者，宮頸鱗癌發(fā)病年齡峰值為40～49歲；對18型感染者從29～69歲年齡段的給予關注，關注的重點是50～59歲、40～49歲、60～69歲3個高發(fā)病年齡段的患者，宮頸鱗癌發(fā)病年齡峰值為50～59歲；對58型感染者從44～87歲年齡段的給予關注，關注的重點是70～79歲、60～69歲、50～59歲、80～89歲4個高發(fā)病年齡段的患者，宮頸鱗癌發(fā)病年齡峰值為70～79歲；對52型感染者從44～90歲年齡段的給予關注，關注的重點是70～79歲、60～69歲、50～59歲3個高發(fā)病年齡段的患者，宮頸鱗癌發(fā)病年齡峰值為70～79歲；其他較常見3種HR-HPV感染型別與發(fā)病年齡的關系見表2；本研究提示16型感染者30歲以下，70歲以上發(fā)病率較低，18型感染者40歲以下發(fā)病率較低，70歲以上無發(fā)病者，58型感染者44歲以下無發(fā)病者，86歲以上無發(fā)病者，52型感染者44歲以下無發(fā)病者，80歲以上發(fā)病率較低。由此可見，HR-HPV感染型別與患者發(fā)病年齡段及風險度存在著差異性。

在2009年美國陰道鏡及宮頸病理學會(ASCCP)的增補版中已明確提出對HPV16型、18型陽性的婦女，建議立即行陰道鏡檢查[8-10]。由于HPV16型、18型為高致癌型HPV，在女性宮頸病變篩查中HPV分型檢測極具必要性。本研究排除多型別HPV感染對型別分析存在著一些干擾因素，從單一HPV感染型別來分析，HPV16型感染率為69.80%，HPV18型感染率為7.52%，HPV58型感染率為5.99%，HPV52型感染率為3.53%，HPV33型感染率為3.41%，HPV31型感染率為3.29%，HPV59型感染率為2.35%。單一16型與18型感染率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，單一18型與58型感染率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，按照HPV16型、18型陽性的婦女，建議直接做陰道鏡檢查的原則，鑒于我國HPV感染的國情單一HPV58型和52型感染女性，尤其是44歲以上的婦女，也應建議直接做陰道鏡檢查。因此，我國應該把a-PV屬第7種和第9種的HPV感染的患者作為重點關注的對象。因不同的HPV型別在宮頸鱗癌患者中的致癌力以及侵襲患者發(fā)病年齡段不盡相同，對宮頸鱗癌前病變患者行HR-HPV分型檢測，不但可給臨床婦產科醫(yī)師提供宮頸高度病變治療前后的型別對比，也可提供不同HPV型別感染與患者發(fā)病年齡段致癌風險度的判斷和評估。

我國從2009年開展對農村婦女宮頸癌的篩查工作，將農村婦女宮頸癌的篩查的年齡劃定在35～64歲的女性作為篩查對象[3，11，12]。依據本研究宮頸鱗癌患者中各主要單一HPV型別感染的年齡段分布情況來看，宮頸鱗癌患者中感染了單一HPV16型、18型、45型、59型年齡在<65歲以下者，接近90%，而≥65歲者在10%～12.5%之間；感染了單一HPV31型和33型年齡在<65歲以下者，在70%左右，而≥65歲者在25%～31%之間；而感染了單一HPV52型和58型年齡在<65歲以下者，在40%～41%之間，而≥65歲者在59%～60%之間。有研究提示，從年齡分布看，HPV16型35歲以下女性中的感染率更高，而HPV52、58型在60歲以上的婦女中更多見[13]。通過宮頸鱗癌患者中HPV感染型別與年齡分布特點分析，我國在行農村婦女宮頸癌篩查時，應該首先采用我國常見高危型HPV作為分型初篩，這樣可以針對女性篩查的高危HPV的型別進行分流，16型和18型感染者建議行p16/ki-67雙染檢查，陽性者行陰道鏡檢查。HPV31型和33型感染者行p16/ki-67雙染檢查，如雙染檢查陰性，1～2年追蹤復查，陽性者均行陰道鏡檢查，HPV52型和58型感染者，如雙染檢查陰性，2～3年追蹤復查，陽性者均行陰道鏡檢查。由于HPV31型和33型及HPV52型和58型感染者存在著HPV感染年齡和宮頸鱗癌發(fā)病年齡延遲現(xiàn)象(≥65歲者在25%～60%之間)，因此，臨床婦產科醫(yī)師對這4種HPV型別感染者更應行高年齡段的隨訪和追蹤復查工作。

總之，本文研究提示HPV16型是致宮頸鱗癌風險度最高的一個型別，發(fā)病率峰值尤其突出，其次是HPV18型、58型、52型、33型、31型、59型、45型。HPV16型和18型更易致病年齡較小的女性群體，而HPV58型和52型則更易致病年齡較大的女性群體。單一16型的致癌高峰年齡段為40～49歲，提示滿足上述條件患者應引起足夠重視，盡早聯(lián)合細胞學檢查，pp16/ki-67雙染等手段進行分流；而單一58型的致癌高峰年齡段為70～79歲，提示HPV58型感染患者患癌年齡延遲現(xiàn)象，臨床應延長對此類患者的隨訪追蹤?，F(xiàn)階段檢測HR-HPV已成宮頸病變篩查的一個主要手段。隨著對宮頸癌致癌機制的深入研究，宮頸病變的篩查策略從原來的以單一細胞學為基礎的篩查轉變?yōu)橐訦R-HPV為基礎的多種篩查手段并存的階段，這也給我國婦產科醫(yī)師帶來了新的挑戰(zhàn)。對持續(xù)性HR-HPV感染陽性患者的病變風險評估及分流判讀尤其重要。因此，宮頸癌篩查的關注點除了宮頸病變防治外，也要重視HR-HPV陽性患者的風險度的判斷和預測，也就是說，婦產科醫(yī)師首先對女性受檢者行HPV分型檢測，并判斷不同型別HPV致癌的風險度，同時結合患者的年齡做出年齡風險度的預判。因p16/ki-67雙染能夠提供HR-HPV檢測陽性患者行陰道鏡分流的同時，對于宮頸病變風險預測均有很好的臨床應用價值。目前，宮頸HR-HPV分型檢測、細胞學檢查和p16/ki-67雙染(宮頸病變篩查分流標記物)檢測已組合使用作為宮頸病變篩查加分流進入臨床，對提高臨床婦產科的宮頸癌篩查的檢出率具有十分重要的作用[14-18]。