HE切片褪色后進行免疫熒光染色的方法探討

高洪彬，梁 十，郭揚清，吳玉娥，賈歡歡，劉 嬋，王希龍，陳梅麗

免疫熒光檢測技術具有專一性強、靈敏度高、實用性好等優(yōu)點[1]，為病理檢測中一項重要的輔助技術。HE染色是常規(guī)的病理學檢測方法，有時HE染色下病變的確診或進一步研究需要進行免疫熒光染色輔助，此時往往會選擇重切蠟塊，但重切的切片與HE觀察不是同一張組織片、需要觀察的位置或多或少的發(fā)生了改變，不利于與原HE切片進行精準的比較分析，更甚者有些組織塊小、重切片未能切出組織切片進行免疫熒光染色。因此，探討一種HE切片褪色后進行免疫熒光染色的方法具有重要的應用價值。本實驗通過實踐，摸索了一些簡便有效的HE切片染色褪色后進行免疫熒光染色的方法并進行比較分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及實驗環(huán)境(普通級)食物蟹猴3只，由廣東春盛生物公司提供[SCXK(粵)2014-0027]，所有涉及實驗動物的實驗方案經(jīng)動物關懷與使用倫理委員會批準。動物飼養(yǎng)場所按照國際實驗動物評估和認證管理委員會的規(guī)定和要求，對動物進行日常的飼養(yǎng)關懷和管理。

1.2 儀器與試劑采用的儀器包括Leica TP1020自動脫水機，Leica EG1150H+C石蠟包埋機，Leica RM2255全自動輪轉(zhuǎn)切片機、Leica ST5020+SV5030全自動染色封片一體機，Leica DM3000正置熒光顯微鏡。

采用的試劑有1%鹽酸乙醇分化液(褪色劑)、胰島素抗原(Gene Tex公司)、PBS緩沖液(博士德生物公司)、胰蛋白酶(南京建成生物工程研究所)、免疫染色封閉液(碧云天生物公司)、熒光二抗(Invitrogen Life Technologies公司)、二甲苯(天津市百世化工公司)、無水乙醇(廣州中南化學有限公司)、95%乙醇(廣州凱秀貿(mào)易有限公司)、1%醇溶性伊紅(廣州凱秀貿(mào)易有限公司)、Harris蘇木精(廣州凱秀貿(mào)易有限公司)、TO透明劑(廣州市中南化工儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1分組 選取3只血糖正常的食蟹猴胰腺常規(guī)脫水包埋后的蠟塊標本，連續(xù)切片后用多聚賴氨酸防脫玻片撈片，分為4組，每組3張，即：空白切片高壓修復免疫熒光組(A組)，空白切片胰蛋白酶修復免疫熒光組(B組)，HE切片褪色后高壓修復免疫熒光組(C組)，HE切片褪色后胰蛋白酶修復免疫熒光組(D組)。

1.3.2HE染色 使用未進行染色的空白切片烤片，然后在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中分別浸泡20 min進行脫蠟，梯度乙醇脫水至純水，每個步驟7 min。Harris蘇木精染色10 min，蘇木精染色結(jié)束后再置于自來水中浸洗1 min，然后進行1%鹽酸乙醇分化5 s，再轉(zhuǎn)移到自來水中返藍15 min。 待返藍結(jié)束后轉(zhuǎn)移到90%乙醇浸泡7 min，然后進行1%醇溶性伊紅染色30 s，在伊紅染色后轉(zhuǎn)移到95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ以及95%乙醇Ⅲ中分別浸泡10 s，然后分別轉(zhuǎn)移到無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ中脫水各5 min，最后在TO透明劑Ⅰ、TO透明劑Ⅱ中分別浸泡7 min，封片。

1.3.3免疫熒光染色 A組：使用未進行染色的空白切片烤片，脫蠟，梯度乙醇水化后PBS沖洗3次、每次5 min，高壓修復(高壓鍋噴氣后5 min停止加熱，待自然冷卻至室溫)，PBS沖洗3次、每次5 min，熒光封閉液封閉1 h，一抗孵育(4 ℃冰箱過夜)，復溫(37 ℃ 60 min)，PBS沖洗3次、每次5 min，二抗孵育(37 ℃ 60 min)，PBS沖洗3次、每次5 min，晾干，封固。B組：與A組比較，抗原使用1.25%胰蛋白酶修復(37 ℃ 30 min)，不使用高壓修復，其余與A組方法步驟相同。C組：使用進行過HE染色的切片二甲苯浸泡，去除蓋玻片和中性樹膠，梯度乙醇水化褪色，放入用75%乙醇配制的1%鹽酸乙醇分化液中浸泡1 min，待晾干后，再放入1%的鹽酸乙醇分化液中1 min，反復數(shù)次直至顏色完全褪去，然后用自來水緩慢沖洗。接著使用PBS沖洗3次、每次5 min，進行高壓修復等與A組相同的步驟和方法進行免疫熒光染色。D組：與C組比較，抗原使用1.25%胰蛋白酶修復(37 ℃ 30 min)，不使用高壓修復，其余步驟與C組方法相同。

1.3.4病理組織學觀察 使用顯微鏡進行組織學觀察。C、D組在HE褪色前進行鏡下觀察和拍照，不同組不同動物的免疫熒光染色切片使用同一熒光強度和倍數(shù)觀察、拍照。

2 結(jié)果

HE染色鏡下觀察，見胰島大小不一、散在分布，胰島細胞呈團索狀分布，胞質(zhì)淡染。各組胰島中均可見INS陽性熒光表達的胰島β細胞。A、C組切片可見部分組織破碎、脫落，B、D組切片未見破碎、脫落。各組各區(qū)域綜合比較，陽性細胞明亮、清晰，各組間抗原表達強度、染色效果未見明顯差異(圖1～4)。

圖1 HE切片褪色后高壓修復免疫熒光組：可見胰島中β細胞呈強陽性，細胞明亮、清晰 圖2 HE切片褪色后胰蛋白酶修復免疫熒光組：可見胰島中β細胞呈強陽性，細胞明亮、清晰 圖3 空白切片高壓修復免疫熒光組：可見胰島中β細胞呈強陽性，細胞明亮、清晰 圖4 空白切片胰蛋白酶修復免疫熒光組：可見胰島中β細胞呈強陽性，細胞明亮、清晰

3 討論

HE染色是組織病理學檢查的常規(guī)檢查方法[2]，石蠟切片在行HE常規(guī)染色步驟包括有機溶劑脫蠟、梯度乙醇水化、蘇木精染色、1%鹽酸乙醇分化、伊紅染色、梯度乙醇脫水、有機溶劑透明、封固等[3]，操作過程在常溫下進行，整個HE染色過程未接觸破壞抗原的溶劑及實驗條件，抗原得到較好的保存。常用的樹脂等封片劑由于溶于有機溶劑二甲苯[4]，經(jīng)二甲苯充分的浸泡可除去蓋玻片并去除組織上附著的封片劑。1%鹽酸乙醇分化液的浸泡可對蘇木精染色的組織細胞進行褪色[5]，有研究報道HE切片經(jīng)過數(shù)次浸泡可進行褪色[6]，提示其對伊紅也有褪色作用，本實驗使用1%鹽酸乙醇分化液對HE染色的切片有較好的褪色效果，鏡下未見組織細胞的蘇木精或伊紅著色。

本實驗觀察到完成褪色的標本，按常規(guī)方法和程序進行免疫熒光染色即可得到較理想效果。同一抗原修復方法下的比較顯示，HE褪色后進行染色的切片與空白片直接染色的切片比較，抗原表達強度相當，提示HE染色及褪色后INS抗原保存得較好。有研究表明酶消化能較好的修復抗原[7-8]，本實驗顯示，對于INS抗原，使用高壓和胰蛋白酶修復均取得較佳染色效果，但胰蛋白酶消化的切片組織塊不易發(fā)生破碎、脫落，較好的保留了待觀察組織的完整性。