干旱脅迫對中華金葉榆盆栽苗內(nèi)源激素的影響*

張世英，劉易超,，李泳潭，黃印冉，張軍

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北省林業(yè)科學(xué)研究院，河北 石家莊 050061)

干旱是影響植物生長發(fā)育、分布和生理生化特性最常見的非生物環(huán)境因素之一[1]，其危害程度在諸多逆境因子中占據(jù)首位。植物內(nèi)源激素是植物自身代謝產(chǎn)生的有機物，可調(diào)控植物的生長發(fā)育，與植物的抗逆性聯(lián)系密切[2]。內(nèi)源激素作為響應(yīng)干旱脅迫重要的生理活性物質(zhì)[3]，植物在受到干旱脅迫后，會調(diào)節(jié)多種內(nèi)源激素的含量及比例來調(diào)控自身的生長發(fā)育，并在某些情況下將干旱脅迫的不利影響降到最低[4]。

中華金葉榆(Ulmuspumila‘Jinye’)為白榆(Ulmuspumila)的天然黃葉突變體，屬榆科(Ulmaceae)榆屬(UlmusL.)植物，是河北省林業(yè)科學(xué)研究院培育的優(yōu)良觀賞品種，已在我國北方地區(qū)廣泛推廣應(yīng)用[5-6]。近年來，對中華金葉榆的研究報道主要集中在嫩枝扦插[6]、葉片呈色[7-8]、苗木繁育[9]和耐寒性等方面[10]。前人對中華金葉榆的研究主要集中在干旱脅迫下苗木生長和保護酶等生理指標(biāo)的響應(yīng)上，有關(guān)金葉榆受到干旱脅迫后其內(nèi)源激素的響應(yīng)變化尚未見報道。本研究采用盆栽苗人工模擬控水法進行干旱脅迫處理，探討金葉榆在不同脅迫程度和時間下的玉米素核苷(zeatin riboside，ZR)、赤霉素(gibberellins，GA)、吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)、脫落酸(abscisic acid，ABA)等4種內(nèi)源激素含量水平及其變化規(guī)律，旨在探索中華金葉榆中內(nèi)源激素對干旱脅迫的響應(yīng)機制，為中華金葉榆抗旱性評價、抗旱機理研究及栽培推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗于2020年8月在河北省林業(yè)科學(xué)研究院(38°05′N，114°47E)進行，溫室透氣透光性良好。供試材料為中華金葉榆的無性系幼苗，在8月初，選取生長良好、長勢一致的幼苗，統(tǒng)一帶土移植到帶有托盤的花盆(上口徑×下口徑×高度為16 cm×16 cm×17 cm)中培養(yǎng)，每盆1株，栽培基質(zhì)為普通園圃土。移植后在自然光照的溫室中進行正常培養(yǎng)，緩苗7 d后，進行干旱脅迫處理。

1.2 試驗方法

1.2.1 干旱脅迫梯度設(shè)置

本試驗設(shè)3個組。每個組內(nèi)3次重復(fù)，每個重復(fù)6株，共18株。以土壤含水量為田間持水量的80%、40%、20%作為對照組(control，CK)、中度干旱脅迫組(mild drought，MD)、重度干旱脅迫組(severe drought，SD)。每天18:00根據(jù)土壤水分狀況及處理要求及時補充土壤水分來保持不同干旱脅迫水平。8月中旬第1次取樣，取樣部位為中華金葉榆頂端幼嫩且無病蟲害的葉片。之后每10 d取樣1次，分別在脅迫的第10、20、30 d時取樣，共取樣4次。取樣后用液氮速凍，立即在室內(nèi)進行內(nèi)源激素含量測定。

1.2.2 內(nèi)源激素含量測定

內(nèi)源激素待測液的制備參考張瑩等[11]的方法。稱取0.3 g葉片置于預(yù)冷的研缽中，加入8 mL甲醇和500 μL抗氧化劑研磨至勻漿，倒入10 mL離心管中，避光放置于4 ℃冰箱靜置浸提12 h。避光條件下，超聲波震蕩1 h，在溫度4 ℃、轉(zhuǎn)速為12 000 r/min條件下離心15 min，取上清液并移至10 mL離心管中，氮吹至水相(1～2 mL)。水相用1 mol/L磷酸二氫鉀，調(diào)至pH 8.0。加入0.2 g PVPP(聚乙烯吡咯烷酮)除雜，超聲波震蕩0.5 h，在溫度4 ℃、轉(zhuǎn)速為12 000 r/min條件下離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管。水相再用1 mol/L檸檬酸調(diào)至pH 3.0，加3 mL乙酸乙酯萃取，超聲波震蕩10 min，放置2 h，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管進行氮吹，直至吹干乙酸乙酯。在乙酸乙酯吹干之前，活化C18小柱：先用4 mL純甲醇，再用4 mL純水。向吹干的離心管加2 mL 20%甲醇復(fù)溶，然后倒入活化好的C18小柱中，最后加2 mL 10%甲醇淋洗，棄除淋出液。用1 mL、pH 8.0的甲醇沖洗C18小柱，回收樣品提取液至新的離心管，用1 mL注射器吸取待測液于棕色小瓶中備用。

使用Agilent-1100高效液相色譜儀測定中華金葉榆幼苗葉片中玉米素核苷(ZR)、赤霉素(GA)、吲哚乙酸(IAA)和脫落酸(ABA)含量，3次生物學(xué)重復(fù)。上機條件參照孫宇[12]的方法，色譜柱為Agilent公司生產(chǎn)的Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)反相色譜柱，流動相及比例為乙腈︰0.7%乙酸︰甲醇為5︰40︰55，流速0.7 mL/min，柱溫30 ℃，進樣前用0.45 μm濾膜過濾，進樣量10 μL，紫外檢測器VWD chemstation(Agilent 1260VWD)波長為254 nm，保留時間10 min。用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算激素含量，每種激素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如下：ZR(y=33.991x-11.707，R2=0.999 5)，GA(y=3.8645x-38.788，R2=0.983 2)，IAA(y=13.144x+7.7295，R2=0.998 9)，ABA(y=66.493x+18.7，R2=0.998 3)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Microsoft Excel 2010進行數(shù)據(jù)的處理、分析，SPSS 22.0軟件進行方差分析和差異顯著性檢驗(α=0.05)，Origin 2019軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對幼苗葉片ZR含量的影響

如圖1A所示，CK組葉片的ZR含量隨著干旱脅迫時間的延長逐漸降低，而MD、SD的ZR含量先降低后升高。脅迫第10 d時，MD、SD組的ZR含量分別較CK組升高72.2%、16.88%；脅迫第20 d時，MD組的ZR含量較CK組升高5.33%，SD組的ZR含量較CK組降低6.95%；脅迫30 d時，MD、SD組的ZR含量分別較CK組升高138.36%、108.42%；同一時間脅迫處理間均達到顯著差異(P<0.05)。

同一處理水平下，脅迫30 d時CK組葉片的ZR含量較脅迫10、20 d分別顯著降低38.85%、30.35%(P<0.05)，而脅迫20 d的ZR含量較脅迫10 d降低12.2%，差異不顯著(P>0.05)；脅迫20 d時MD、SD組葉片的ZR含量較脅迫10 d分別降低46.3%、30.11%，脅迫30 d較脅迫20 d其ZR含量分別升高57.63%、56.02%，均有顯著差異(P<0.05)。

圖1 干旱脅迫對中華金葉榆葉片4種內(nèi)源激素含量的影響

2.2 干旱脅迫對幼苗葉片GA含量的影響

如圖1B所示，CK組葉片的GA含量隨著脅迫時間的延長呈升高趨勢，MD組先降低后升高，SD組逐漸降低。與CK相比，MD、SD組葉片的GA含量在脅迫10 d分別顯著增加1.60、1.32倍(P<0.05)；脅迫20 d時，MD、SD組葉片的GA含量較CK組分別增加32.35%、24.17%，均差異顯著(P<0.05)；而在脅迫30 d時，MD、SD組葉片的GA含量均顯著低于CK組(P<0.05)，分別降低24.83%、62.26%。

脅迫20、30 d時的CK組葉片的GA含量較脅迫10 d分別增加8.2%、96.67%，均差異顯著(P<0.05)；僅MD組而言，脅迫20、30 d的GA含量較脅迫10 d分別顯著降低44.88%、43.1%(P<0.05)，SD組的GA含量在脅迫20、30 d較脅迫10 d分別降低42.01%、67.97%，均有顯著差異(P<0.05)。

2.3 干旱脅迫對幼苗葉片IAA含量的影響

如圖1C所示，隨著干旱脅迫時間的延長，CK組葉片的IAA含量逐漸增加，MD、SD組葉片的IAA含量在脅迫第10 d高于CK組，后逐漸降低。脅迫10 d時，MD、SD組葉片的IAA含量較CK組分別顯著增加3.38、2.73倍(P<0.05)；脅迫20 d時，CK、MD、SD葉片的IAA含量差別縮小；脅迫30 d時，MD、SD組葉片的IAA含量較CK組分別顯著降低45.98%、61.12%(P<0.05)。

脅迫20、30 d時的CK組葉片的IAA含量較脅迫10 d分別增加79.22%、178.09%；僅MD組而言，脅迫20、30 d的IAA含量較脅迫10 d分別降低55.17%、65.71%；SD組的IAA含量在脅迫20、30 d較脅迫10 d分別降低41.60%、70.98%；同一處理在不同時間均有顯著差異(P<0.05)。

2.4 干旱脅迫對幼苗葉片ABA含量的影響

與干旱脅迫下ZR、GA、IAA含量變化趨勢不同，如圖1D所示，隨著脅迫時間的延長，CK組葉片的ABA含量逐漸降低，MD、SD組葉片的ABA含量均在脅迫20 d達到最大值，分別為386.63 ng/g、364.46 ng/g。脅迫10 d時，MD、SD組葉片的ABA含量較CK組分別顯著增加41.37%、105.91%(P<0.05)；脅迫20 d時，MD、SD組葉片的ABA含量較CK組分別顯著增加2.26、2.08倍(P<0.05)；脅迫30 d時，MD、SD組葉片的ABA含量較CK組分別顯著增加135.03%、65.27%(P<0.05)。

2.5 干旱脅迫對幼苗葉片中內(nèi)源激素比例的影響

由表1可知，隨著干旱脅迫時間的延長，CK組中華金葉榆幼苗葉片中GA/ABA、IAA/ABA、GA/ZR、IAA/ZR值逐漸上升，ZR/ABA值逐漸下降，IAA/GA呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；MD、SD組的ZR/ABA、GA/ABA、IAA/ABA值呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，GA/ZR、IAA/ZR值逐漸下降；MD組的IAA/GA值逐漸下降，而SD組的IAA/GA值先上升后下降。脅迫20 d時，MD、SD組的ZR/ABA值低于CK組，而在脅迫30 d時，MD、SD組的ZR/ABA值較CK組分別升高1.44%、25.91%。脅迫10 d時，MD、SD組的GA/ABA值高于CK組；隨后CK組的GA/ABA值逐漸升高，MD、SD組的GA/ABA值在脅迫20 d和30 d較CK組分別降低59.51%、59.74%，68%、77.2%。脅迫10 d時，MD、SD組的IAA/ABA值高于CK組；隨著脅迫時間的延長，CK組的IAA/ABA值逐漸升高，MD、SD組的IAA/ABA值總體降低；脅迫30 d時MD、SD組的IAA/ABA值較CK組降低77.02%、76.44%。MD、SD組的GA/ZR值在脅迫10、20 d均高于CK組；隨后CK組的GA/ZR值逐漸升高，MD、SD組的GA/ZR值總體降低；在脅迫30 d，MD、SD組的GA/ZR值均低于CK組，且較CK組降低68.47%、81.9%。脅迫10、20 d時，MD、SD組的IAA/ZR值均高于CK組，而在脅迫30 d，MD、SD組的IAA/ZR值均低于CK組，且較CK組降低77.33%、81.34%。在脅迫的各個時間，CK、MD、SD組的IAA/GA值變化不大。

總的來說，干旱脅迫下ZR/ABA、GA/ABA、IAA/ABA、GA/ZR、IAA/ZR、IAA/GA值逐漸下降，前3個指標(biāo)的下降幅度較大，后3個指標(biāo)的下降幅度較小。說明中華金葉榆通過降低內(nèi)源激素的含量比以維持內(nèi)源激素間的平衡來抵御干旱環(huán)境。

表1 干旱脅迫下中華金葉榆葉片內(nèi)源激素含量的比例變化

3 討論

內(nèi)源激素在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮了極其重要的作用，控制著植物生長的整個過程，還可調(diào)節(jié)植物種子的萌發(fā)、發(fā)育分化、衰老、器官脫落等有規(guī)律的生命活動[13]，不同的內(nèi)源激素在植物生長發(fā)育過程所起到的作用不盡相同，在極低濃度下就能產(chǎn)生明顯的生理效應(yīng)[14]，可以單獨或者交互調(diào)控植物的生長、發(fā)育和代謝等過程[15]。ZR、GA、IAA 等3種內(nèi)源激素均可起到促進植物生長發(fā)育的作用。

ZR能夠促進細胞分裂分化、減緩葉片衰老的速度，干旱脅迫下植物的根最先感受到脅迫，并抑制根中ZR的合成及運輸，植物根中的ZR含量變化較為明顯，葉中的ZR含量具有不同的變化趨勢且變化幅度不大[16]。本試驗結(jié)果表明，隨著干旱脅迫時間的延長，與CK組相比，MD、SD組的ZR含量均呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢；脅迫20 d時，幼苗根部感受到干旱脅迫壓力，減少了ZR的合成及向上部的輸送，從而使得MD、SD組ZR含量降低；而脅迫30 d時，MD、SD組的ZR含量迅速增加可起到延緩幼苗葉片衰老以維持植物體正常生命活動的作用，這與丁少凈等[17]對油茶(Camelliaoleifera)葉片的研究結(jié)果一致，與滿達等[18]對差巴嘎蒿(Artemisiahalodeudrou)苗的研究結(jié)果不一致，這也說明了不同植物的ZR對干旱環(huán)境的響應(yīng)機制不盡相同。

GA是一類非常重要的促進植物生長發(fā)育的天然調(diào)節(jié)激素，也是一種生長促進劑[19]，在促進細胞伸長、分裂，促進氣孔關(guān)閉、減少水分蒸騰[15]等方面發(fā)揮重要作用，與此同時促進植物體生長發(fā)育。本研究表明，CK組的GA含量隨著脅迫時間的延長呈上升趨勢，而MD、SD組的GA含量逐漸下降，可知植物體內(nèi)的GA在響應(yīng)干旱環(huán)境應(yīng)答的同時，需要降低自身的代謝消耗，所以植物體會降低GA的合成從而保證抵御干旱脅迫。

IAA是天然植物生長素的主要活性成分[20]，IAA的主要生物學(xué)功能是促進細胞極性發(fā)育及細胞的伸長、分裂[21]，還可調(diào)節(jié)根部代謝，使根部吸收更多的水分來抵御干旱脅迫[22-23]。干旱脅迫對植物內(nèi)源細胞IAA含量的影響較復(fù)雜，不同植物處于干旱環(huán)境下其體內(nèi)IAA含量呈現(xiàn)不同的變化[3]，韓瑞宏等[24]研究表明，紫花苜蓿(Medicagosativa)葉片中IAA含量隨著干旱脅迫增強而增加；本研究顯示，中華金葉榆幼苗葉片中的IAA含量在MD、SD組隨著脅迫時間的增加而減少，這與全文選等[25]對馬尾松(Pinusmassoniana)幼苗和敖紅等[26]對云杉(Piceaasperata)在干旱脅迫下IAA含量變化的研究結(jié)果一致。

ABA是一種對植物生長發(fā)育、抗逆性、氣孔運動和基因表達均有重要調(diào)節(jié)功能的植物內(nèi)源激素[27]。在植物受到干旱脅迫時，ABA可作為信號分子誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉，從而增強植物的抗旱能力[24]，也被稱為“脅迫激素”。本研究表明，脅迫10 d時，中華金葉榆幼苗葉片中ABA含量隨脅迫程度的增加呈現(xiàn)升高的趨勢，這有利于植物葉片氣孔關(guān)閉、減少蒸騰，減輕細胞膜的受損程度，以提高中華金葉榆的抗旱性和保水性[26]，這與Krishnan S等[28]的研究結(jié)果一致；隨著脅迫時間的延長和脅迫程度的增加，中華金葉榆以其體內(nèi)ABA抵御干旱環(huán)境的能力降低導(dǎo)致MD、SD組的ABA含量均降低。

內(nèi)源激素對植物至關(guān)重要，有研究表明，在植物種子休眠解除[29]和生長發(fā)育[30]的過程中受到多種內(nèi)源激素的相互作用、相互調(diào)控。干旱脅迫下，植物一方面通過調(diào)節(jié)體內(nèi)激素水平來調(diào)控生長發(fā)育，另一方面通過改變不同激素間的含量比來影響自身生長。本研究中，與CK組相比，ZR/ABA、GA/ABA、IAA/ABA逐漸降低，且降幅較大。ABA含量增加可以促進氣孔關(guān)閉、減少蒸發(fā)，GA和IAA含量降低可以促進地下部分生長、抑制地上部分生長，同時ZR含量的減少也會使得細胞分裂素向地上部分的輸送受阻，也會抑制地上部分的生長，表明中華金葉榆主要通過抑制自身生長發(fā)育來降低干旱脅迫傷害，與李文嬌等[31]的研究結(jié)果類似。同時中華金葉榆葉片中GA/ZR、IAA/GA與CK相比復(fù)雜多變，說明中華金葉榆通過改變內(nèi)源激素間的比例來適應(yīng)干旱脅迫環(huán)境。