一種甲氨基阿維菌素膠體金免疫快速檢測試紙條的研制

吳廣 賈芳芳 馮才偉 崔娜 崔海峰

本文通過制備甲氨基阿維菌素半抗原，研制出一種能夠檢測蔬菜、水果中甲氨基阿維菌素的膠體金免疫層析試紙條，檢測限為5μg/kg，檢測時(shí)間為15min，假陽性率和假陰性率均為零，符合《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》要求。此外，該試紙條適用于基層實(shí)驗(yàn)室的大批量樣本檢測，具有實(shí)際意義，且未見免疫方法相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，故具有創(chuàng)新性。

甲氨基阿維菌素是從發(fā)酵產(chǎn)品阿維菌素B1開始合成的一種新型高效半合成抗生素殺蟲劑，溶于丙酮和甲醇、微溶于水、不溶于己烷。因其具有超高效、低毒、低殘留、無公害等生物農(nóng)藥的特點(diǎn)，故被廣泛應(yīng)用于蔬菜、果樹、棉花等農(nóng)作物中以防治多種害蟲。但是，該藥物具有神經(jīng)毒性和發(fā)育毒性，脂溶性強(qiáng)，在動(dòng)物體內(nèi)分布廣泛且代謝周期長，容易造成藥物殘留，進(jìn)而通過食物鏈危害人體健康。因此，對(duì)食品中的甲氨基阿維菌素殘留量進(jìn)行檢測十分必要。

目前，用于檢測甲氨基阿維菌素殘留量的方法大多為儀器方法，但儀器采購成本高、檢測時(shí)間長、操作復(fù)雜，不符合基層實(shí)驗(yàn)室高效、便捷的檢測要求。因此，本文制備出一種甲氨基阿維菌素的單克隆抗體，并將其應(yīng)用于膠體金免疫層析試紙條，使其能夠滿足基層實(shí)驗(yàn)室的檢測需求，有利于豐富監(jiān)管手段和提高監(jiān)督水平。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲氨基阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素等標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%），購自北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心;氯金酸（HAuCl4·3H2O）、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA），購自美國Sigma公司;檸檬酸三鈉、碳酸鉀，購自北京百欣試劑公司;樣本提取劑、樣本復(fù)溶液、膠體金分析儀，由北京勤邦生物技術(shù)有限公司提供;渦旋儀、均質(zhì)器，購自湖南湘立科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 甲氨基阿維菌素半抗原的制備

取0.886g甲氨基阿維菌素，加乙腈70mL溶解，加0.91g氨基丙酸的水溶液2mL，充分?jǐn)嚢韬蠹尤?7%甲醛0.32mL與三氯乙酸0.77g，加熱，于60℃反應(yīng)12h，反應(yīng)停止后加水80mL與乙酸乙酯100mL，萃取分離，減壓蒸干，上硅膠柱，石油醚/乙酸乙酯體積比5：1洗脫分離，得到丙酸甲氨基阿維菌素半抗原0.76g，收率為77%。

1.2.2 免疫原的制備——甲氨基阿維菌素半抗原與牛血清白蛋白（BSA）偶聯(lián)物合成

取丙酸甲氨基阿維菌素半抗原產(chǎn)物36mg，加DMF1mL，溶解澄清，加EDC27mg與NHS19mg，充分混勻后反應(yīng)4h，得到半抗原活化液A液;取牛血清白蛋白（BSA）50mg，加0.05M PB溶解，得到B液;將A液滴加到B液中，于4℃反應(yīng)24h后0.02M PBS透析純化3天，每天換液3次，得到甲氨基阿維菌素-BSA偶聯(lián)物，即為免疫原，分裝后于-20℃保存。

1.2.3 免疫原的制備——甲氨基阿維菌素半抗原與卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)物合成

取丙酸甲氨基阿維菌素半抗原產(chǎn)物22mg，加DMF1mL，溶解澄清，加EDC17mg與NHS13mg，充分混勻后反應(yīng)4h，得到半抗原活化液A液;取卵清白蛋白（OVA）50mg，加0.05M PB溶解，得到B液;將A液滴加到B液中，于4℃反應(yīng)24h后0.02M PBS透析純化3天，每天換液3次，得到甲氨基阿維菌素-OVA偶聯(lián)物，即為免疫原，分裝后于-20℃保存。

1.2.4 膠體金的制備

取0.01%氯金酸水溶液100mL加熱至沸騰;一邊攪拌，一邊準(zhǔn)確加入1%檸檬酸三鈉溶液1.5mL;待氯金酸水溶液變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)煮沸15min，冷卻后于4℃避光保存。

1.2.5 甲氨基阿維菌素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備

在磁力攪拌下，用0.2mol/L Na2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值至7.2;每毫升膠體金溶液中加入50μg甲氨基阿維菌素單克隆抗體，混勻后靜置10min，加入10%BSA，使其在膠體金溶液中的體積百分含量為1%，靜置10min;離心、洗滌、重懸，放置4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 將甲氨基阿維菌素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干到微孔試劑上

將100μL甲氨基阿維菌素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物加入至微孔試劑微孔板中，置于冷凍干燥機(jī)，冷阱溫度為-50℃，預(yù)凍3h，然后真空干燥15h，即得到甲氨基阿維菌素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干的微孔試劑。

1.2.7 檢測方法

向微孔中加入100μL待測樣本溶液，混勻，室溫下孵育3min，吸取70μL滴至試紙條上，反應(yīng)10min，根據(jù)示意圖（如圖2）判定結(jié)果或通過膠體金分析儀讀取檢測結(jié)果。需注意，其它時(shí)間判讀無效。

1.2.8 樣本檢測限

向空白蔬菜、水果樣本中分別添加甲氨基阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0、1、3、5、7、9μg/L，按照“1.2.7”所述方法用3批試紙條進(jìn)行檢測，每個(gè)濃度重復(fù)5次，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定樣本檢測限。

1.2.9 試紙條的特異性

分別配制500μg/L的伊維菌素、多拉菌素等藥物，用膠體金免疫層析試紙條檢測，重復(fù)3次，判斷試紙條的特異性。

1.2.10 準(zhǔn)確性

農(nóng)業(yè)部文件要求：以假陽性率和假陰性率表示膠體金免疫層析法的準(zhǔn)確性。取經(jīng)過儀器確證的50份陰性蔬菜、水果樣品（質(zhì)量濃度小于5μg/kg）與50份陽性蔬菜、水果樣品（質(zhì)量濃度大于5μg/kg），用膠體金免疫層析試紙條進(jìn)行檢測甲氨基阿維菌素藥物殘留量，計(jì)算假陽性率和假陰性率?！掇r(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》規(guī)定，試紙條假陽性率應(yīng)小于5%，假陰性率應(yīng)為零。

1.2.11 試紙條的穩(wěn)定性

將膠體金免疫層析試紙條保存于2～8℃環(huán)境中，每隔1個(gè)月檢測試紙條的準(zhǔn)確性，連續(xù)測定15個(gè)月。具體方法為：分別檢測經(jīng)過儀器確證的20份陰性蔬菜、水果樣品（質(zhì)量濃度小于5μg/kg）與20份陽性蔬菜、水果樣品（質(zhì)量濃度大于5μg/kg），重復(fù)測定2次，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定試紙條的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1膠體金的鑒定

肉眼觀察制備的膠體金，其顏色為酒紅色、均勻度較好、無雜質(zhì)、透明度較高。取冷卻后的膠體金溶液在透射電鏡下觀察其顆粒的均一程度并測量金顆粒粒徑。經(jīng)透射電鏡觀察，膠體金顆粒分布比較均勻，金顆粒的粒徑約為20nm。

2.2樣本檢測限

配置甲氨基阿維菌素濃度分別為0、1、3、5、7、9μg/L的蔬菜、水果樣品，按照“1.2.7”步驟進(jìn)行檢測，確定檢測限。該試紙條的檢測限為5μg/kg，見表1。

2.3特異性

使用膠體金免疫層析試紙條檢測500μg/L的伊維菌素、多拉菌素等藥物，結(jié)果均呈陰性，表明該試紙條特異性較好。

2.4準(zhǔn)確性

用膠體金免疫層析試紙條檢測50份陰性蔬菜、水果樣品，檢測結(jié)果均為陰性，說明假陽性率低于5%;用該試紙條檢測50份陽性蔬菜、水果樣品，試紙條檢測結(jié)果均為陽性，說明該試紙條假陰性率為零，符合《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》要求。

2.5 穩(wěn)定性

12個(gè)月內(nèi)，膠體金免疫層析試紙條的假陽性率和假陰性率均符合相關(guān)要求。從第13個(gè)月起，該試紙條會(huì)出現(xiàn)少量失效、假陽性等現(xiàn)象。

3 討論

本研究通過制備甲氨基阿維菌素半抗原，讓其與載體蛋白偶聯(lián)得到免疫原，最終制備出商品化的膠體金免疫層析試紙條。按照《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》要求，本研究對(duì)試紙條進(jìn)行了特異性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性等性能測試，結(jié)果均符合要求。膠體金免疫層析試紙條的檢測時(shí)間僅為15min，比現(xiàn)有文獻(xiàn)中的儀器方法用時(shí)更短，操作更簡便。并且，該試紙條檢測限為5μg/kg，靈敏度較高。