一種枯草芽孢桿菌的計(jì)數(shù)方法

王梅 盧宗梅 陳影 周勇 邴狄祥 劉利利 郭世堂 徐曉然

摘? ? ? 要：為了對一株高度黏連的產(chǎn)多種酶的枯草芽孢桿菌進(jìn)行有效的活菌計(jì)數(shù)，試驗(yàn)采用普通培養(yǎng)基，蛋白胨添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、0.5%，牛肉粉和牛肉膏添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%，氯化鈉添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、0.5%，瓊脂粉添加量1.5%、3.0%，在不同添加量下進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)及芽孢計(jì)數(shù)研究分析。試驗(yàn)結(jié)果表明：普通培養(yǎng)基平板蛋白胨、牛肉粉和牛肉膏、氯化鈉不同添加量條件下，該菌株枯草芽孢桿菌在平板顯示菌落個(gè)數(shù)仍然比較大，菌落黏連在一起，造成計(jì)數(shù)偏低，難以形成有效的活菌計(jì)數(shù)，對產(chǎn)品質(zhì)量無法準(zhǔn)確判斷。針對這種情況，最終優(yōu)化出一種合適平板培養(yǎng)基，蛋白胨1%、牛肉膏0.3%、氯化鈉0.5%、瓊脂粉3.0%（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)），使本菌能夠生長并菌落獨(dú)立，計(jì)數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好。說明在活菌計(jì)數(shù)和芽孢計(jì)數(shù)中，優(yōu)化培養(yǎng)基是某些特殊菌株（菌落黏連）的理想計(jì)數(shù)方法。

關(guān)? 鍵? 詞：枯草芽孢桿菌;培養(yǎng)基;計(jì)數(shù)

中圖分類號： TQ016.1? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A? ? ? 文章編號： 1671-0460（2020）09-1930-04

Abstract： In order to count a highly adherent bacillus subtilis which can produce multiple enzymes， in the experiment， the viable bacteria count and spore count were studied by adding 1%，0.5% peptone， 0.3% beef powder and beef extract， 1% or 0.5% sodium chloride， 1.5% or 3.0% agar powder. The results showed that the number of colonies of Bacillus subtilis was still relatively large on the plate with the common medium containing peptone， beef powder， beef extract and sodium chloride， and the colonies adhered together， resulting in a low count， it was difficult to form an effective count of viable bacteria， and the quality of products could not be accurately judged. In view of this situation， a suitable plate culture medium was finally optimized， containing peptone 1% ， beef extract 0.3% ， sodium chloride 0.5% and agar powder 3.0% . It was shown that the optimum medium was an ideal method for counting some special strains （colony adhesion） in the enumeration of living bacteria and spores.

Key words： Bacillus subtilis; Medium; Counting

枯草芽孢桿菌是我國允許使用的飼料微生物菌種，因其無毒、無害，經(jīng)常被制成微生物添加劑，枯草芽孢桿菌在制劑中以內(nèi)生孢子形式存在。微生物飼料添加劑年產(chǎn)量已經(jīng)超過二十幾萬噸，目前我國從事生物飼料行業(yè)的企業(yè)數(shù)量已經(jīng)超過一千多家，發(fā)酵飼料年產(chǎn)品產(chǎn)量一百多萬噸[1-2]。枯草芽孢桿菌已經(jīng)作為微生物菌劑對外銷售，國家對于微生物菌劑以及發(fā)酵飼料方面質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及控制，將不斷的規(guī)范化。

枯草芽孢桿菌是一類好氧細(xì)菌，芽孢桿菌能產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，還可以抑制動物腸道中有害菌的生長，維持動物腸道的生態(tài)平衡 [3]。

微生態(tài)制劑及培養(yǎng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)，一般經(jīng)常使用的方法有平板稀釋法、吸光值法、顯微鏡檢測法? ?等[4-5]，在活菌計(jì)數(shù)和芽孢計(jì)數(shù)中， 目前最穩(wěn)定且可靠是平板稀釋計(jì)數(shù)法。

在現(xiàn)階段的工業(yè)化生產(chǎn)中，本菌株枯草芽孢桿菌生長繁殖迅速，普通培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)，菌落黏連在一起，單獨(dú)菌落個(gè)數(shù)比較大，活菌數(shù)和芽孢數(shù)計(jì)數(shù)偏低，對產(chǎn)品質(zhì)量無法準(zhǔn)確判斷，針對這種情況，進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化，調(diào)整氮源、碳源、有機(jī)鹽、瓊脂粉添加量，最終優(yōu)化培養(yǎng)基使本菌能夠生長并且菌落獨(dú)立、準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。

1? 實(shí)驗(yàn)部分

1.1? 菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus sublilis）由中糧生物科技股份有限公司研發(fā)基地分離、鑒定并保存菌種，菌種編號ZLK1。

1.2? 培養(yǎng)基

普通培養(yǎng)基： 蛋白胨10 g， 牛肉粉3.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 000 mL， pH 7.0+0.2，121 ℃滅菌20 min。

優(yōu)化培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂粉30 g，蒸餾水1 000 mL， pH 7.0+0.2，121 ℃滅菌20 min。

1.3? 試驗(yàn)方法[6]

平板菌落計(jì)數(shù)法是根據(jù)微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成的現(xiàn)象進(jìn)行的，也就是說一個(gè)菌落即代表一個(gè)單細(xì)胞。

首先將培養(yǎng)皿裝進(jìn)不銹鋼桶里，然后放入烘箱180 ℃干熱滅菌2～3 h，放無菌室凈化臺冷卻待用。

分別將配好的普通培養(yǎng)基和優(yōu)化培養(yǎng)基121 ℃滅菌20 min，冷卻至50～40 ℃左右，在無菌室凈化臺上，將其倒入已干熱滅菌的培養(yǎng)皿中，約? ?20 mL/90 mm培養(yǎng)皿，等冷卻凝固后，把倒置培養(yǎng)皿放入35 ℃培養(yǎng)箱中空培養(yǎng)24～48 h，最后把培養(yǎng)皿裝進(jìn)不銹鋼桶里，放置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

準(zhǔn)確的稱取樣品5.00 g（或5.00 mL），置入? ? 45 mL無菌水的帶擋板的三角瓶中，震蕩器震動? 30 min，即為1∶10的稀釋液。

從1∶10的稀釋液中吸取0.1 mL置入0.9 mL無菌水的玻璃試管中，用振蕩器混勻。

依次按照10倍的稀釋液稀釋，每次稀釋前，一定要換無菌的吸頭，選擇合適的稀釋梯度，吸取? 0.1 mL稀釋液放入空培養(yǎng)的平板中，用涂布棒將稀釋好的菌液涂布均勻，每個(gè)稀釋梯度涂幾塊平行平板，倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后取出計(jì)數(shù)。

選取菌落數(shù)在30～300個(gè)之間的平皿計(jì)數(shù)，不黏連、單獨(dú)菌落生長的平皿計(jì)算菌落總數(shù)。大于300個(gè)菌落的平皿記錄為不可計(jì)。低于30個(gè)菌落的平皿記錄具體菌落數(shù)，每個(gè)稀釋梯度的菌落數(shù)取3塊平皿的平均數(shù)，若只有一個(gè)稀釋梯度平皿上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算2塊平皿菌落數(shù)的平均值， 取平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，即得每克或每毫升樣品所含枯草芽孢桿菌發(fā)酵液活菌的總數(shù)。

1.4? 主要設(shè)備

培養(yǎng)箱，MIR-162三洋恒溫培養(yǎng)箱，旋渦震蕩器，分析天平，YXQ高壓滅菌鍋，水浴鍋，90 mm培養(yǎng)皿，蜀牛牌三角燒瓶（規(guī)格1 000 mL和250 mL），移液器，移液槍頭，1 mL和5 mL吸管，離心管，18×180試管，涂布棒，不銹鋼培養(yǎng)皿桶，電磁爐，不銹鋼鍋。

2? 結(jié)果與討論

2.1? 蛋白胨

蛋白胨是一種外觀呈淡黃色的粉劑，蛋白胨當(dāng)中不僅含有豐富的氨基酸、細(xì)菌需要生長的維生素和其他生長因子，還含有許多硫氨基酸等。蛋白胨在培養(yǎng)基當(dāng)中起的主要作用是提供氮源。

有機(jī)氮源不但含有某些生長因子以及少量脂肪、糖類、維生素，而且含有豐富的蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸等。因此在含有有機(jī)氮源的培養(yǎng)基中微生物不但生長特別旺盛，而且菌體數(shù)量增長快速，代謝產(chǎn)物積累豐富 [7-8]。

由表1可知優(yōu)化后培養(yǎng)基調(diào)整氮源從1.0%降到0.5%，用枯草芽孢桿菌發(fā)酵終點(diǎn)種子液稀釋涂布，結(jié)合圖1分析可知，調(diào)整氮源添加量對菌落生長、蔓延沒有影響，菌落個(gè)數(shù)依然比較大，菌落易黏連在一起。

2.2? 牛肉粉和牛肉膏

牛肉粉則以牛肉為原料，經(jīng)熱處理，過濾，濃縮，干燥制成牛肉原粉，再將牛肉原粉經(jīng)過水解，固液分離，冷藏，過濾，濃縮及干燥等工序即可獲得牛肉粉，其能為微生物提供碳源、能源、磷酸鹽和維生素。牛肉粉和牛肉膏的作用同為微生物提供碳源、磷酸鹽、維生素。牛肉粉添加量0.3%，牛肉膏添加量0.5%、0.3%。結(jié)果如圖2所示。

普通培養(yǎng)基牛肉粉添加量0.3%牛肉粉和優(yōu)化培養(yǎng)基牛肉膏添加量分別為0.3%、0.5%。同樣用枯草芽孢桿菌發(fā)酵終點(diǎn)種子液稀釋涂布，由平板結(jié)果顯示，牛肉膏添加0.3%和0.5%在平板培養(yǎng)基中無明顯區(qū)別。用牛肉粉替代牛肉膏是可行的。由圖2菌株形態(tài)可知，菌落個(gè)數(shù)依然大，菌落易蔓延，無法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。牛肉粉和牛肉膏添加培養(yǎng)基中對菌落生長影響不明顯。

2.3? 氯化鈉

氯化鈉是微生物發(fā)酵培養(yǎng)基的必要成分，鈉離子能夠維持細(xì)胞滲透壓，因此需要在培養(yǎng)基中加入少量的鈉鹽，但添加量不能過高，否則影響微生物的生長[8-9]?？莶菅挎邨U菌在5%的NaCl溶液中能正常生長，而在10%的NaCl溶液中生長受到抑制。

優(yōu)化普通培養(yǎng)基中的氯化鈉添加量，由0.5%調(diào)整到1%，同樣用枯草芽孢桿菌發(fā)酵終點(diǎn)種子液稀釋涂布，結(jié)果如圖3所示，菌落個(gè)數(shù)依然大，菌落生長易蔓延、易黏連一起，無法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。1%氯化鈉添加量未影響枯草芽孢桿菌生長。說明氯化鈉添加量0.5%和1%對枯草芽孢桿菌生長及菌落變化沒有顯著影響，只有在10%的NaCl溶液中枯草芽孢桿菌生長受到抑制。

2.4? 瓊脂粉

瓊脂粉不溶于冷水，緩溶于熱水中，更容易在沸水中溶解 [10]。瓊脂起凝固劑作用，在普通培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上優(yōu)化培養(yǎng)基中的瓊脂粉由1.5%調(diào)整到3.0%，配制成平板培養(yǎng)基，同樣用枯草芽孢桿菌發(fā)酵終點(diǎn)種子液稀釋涂布，結(jié)果如圖5所示，菌落呈圓形，邊緣整齊，不蔓延，菌落獨(dú)立生長，比普通培養(yǎng)基中瓊脂粉多加一倍。

2.5? 普通培養(yǎng)基和優(yōu)化培養(yǎng)基配方對比

由表2可知，普通培養(yǎng)基里用的是牛肉粉，而優(yōu)化培養(yǎng)基用的是牛肉膏，普通培養(yǎng)基的瓊脂粉添加量是1.5%，而優(yōu)化培養(yǎng)基的瓊脂粉添加量是3.0%，瓊脂粉多加一倍的量。

2.6? 兩種平板多次計(jì)數(shù)對比結(jié)果

研究對枯草芽孢桿菌進(jìn)行普通培養(yǎng)基平板和優(yōu)化培養(yǎng)基平板多次計(jì)數(shù)，表3是取3次枯草芽孢桿菌發(fā)酵液活菌計(jì)數(shù)的結(jié)果。由表3可知，普通培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)的結(jié)果比較低，而從優(yōu)化培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)的結(jié)果來看，梯度性、平行性非常好，菌落易計(jì)數(shù)。另外，從涂平板后菌落的獨(dú)立生長易計(jì)數(shù)。說明瓊脂粉添加量由1.5%調(diào)整到3.0%，根據(jù)平板結(jié)果可知，優(yōu)化培養(yǎng)基平板菌落分布均勻、獨(dú)立，該方法也非常穩(wěn)定、可靠。

2.7? 枯草芽孢桿菌芽孢菌落計(jì)數(shù)[6]

首先以無菌操作稱取枯草芽孢桿菌發(fā)酵液5 mL，加入45 mL 0.85%滅菌生理鹽水中，用振蕩器混勻1～2 min， 制成1∶10的初始懸浮液。吸取1∶10的初始懸浮液1 mL，加入9 mL 0.85%滅菌生理鹽水中，經(jīng)振蕩器混勻后制成1∶100的稀釋液。根據(jù)樣品含菌量，做進(jìn)一步的十倍系列遞增稀釋。

選擇2～3個(gè)適宜的稀釋度，水?。?0±1） ℃維持10 min，用無菌移液槍頭吸取0.1 mL，接種到培養(yǎng)皿中，使用涂布棒均勻分布于平皿中的培養(yǎng)基內(nèi)，涂布好的平皿蓋好，置室溫放置15 min使接種物完全被瓊脂吸收。放置30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，如圖4所示，在普通培養(yǎng)基平板上有10-6? 53個(gè)菌落，菌落呈水滴狀，好多菌落黏連在一起，菌落比較大，易覆蓋其他菌落，無法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。

優(yōu)化培養(yǎng)基如圖5所示，菌落呈圓形，邊緣整齊， 在同一個(gè)梯度上，10-6 152個(gè)菌落，優(yōu)化培養(yǎng)基的菌落比普通培養(yǎng)基培養(yǎng)菌落生長的個(gè)數(shù)多，易準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。

結(jié)果表明，該菌株在普通培養(yǎng)基平板上生長，菌落呈水滴狀且具有較高黏連性，不適合在普通培養(yǎng)基培養(yǎng)計(jì)數(shù)。而在優(yōu)化培養(yǎng)基中瓊脂粉添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)由1.5%提高3.0%，使培養(yǎng)基硬度適宜，不影響本菌株生長，菌落邊緣不蔓延，不黏連在一起，菌落邊緣整齊，菌落分布均勻，能夠準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。

通過對培養(yǎng)枯草芽孢桿菌平板培養(yǎng)基各項(xiàng)指標(biāo)分析及對比驗(yàn)證，該菌株枯草芽孢桿菌適宜在優(yōu)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，不會抑制菌落生長，菌落邊緣整齊，不蔓延，不黏連在一起，易準(zhǔn)確菌落計(jì)數(shù)。因此，在活菌計(jì)數(shù)和芽孢計(jì)數(shù)中，優(yōu)化培養(yǎng)基是適合本菌株枯草芽孢桿菌的最佳計(jì)數(shù)方法。

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