格利特消毒劑對(duì)高致病性禽流感病毒的抗病毒效力

霍天武 李亞雄 孟艷莉

摘? 要：根據(jù)美國國家環(huán)境保護(hù)局（EPA）制定的關(guān)于抗病毒劑類注冊(cè)產(chǎn)品的測試標(biāo)準(zhǔn)和方法，將格利特消毒劑稀釋至使用濃度，處理被病毒附著污染的物體表面，測定回收病毒的侵染能力和病毒侵染性的降低程度，證明1 000 mg/kg格利特消毒劑稀釋液符合EPA標(biāo)準(zhǔn)，是殺病毒劑。

關(guān)鍵詞：戊二醛;格利特消毒劑;高致病性禽流感

中圖分類號(hào)：S859.79 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2020）08-0085-04

本研究的目的是測評(píng)以戊二醛為主要有效成分的消毒劑對(duì)高致病性禽流感（Highly Pathogenic Avian Influenza，HPAI）H5N1病毒亞型的消毒效果。根據(jù)美國國家環(huán)境保護(hù)局（Environmental Protection Agency，EPA）制定的關(guān)于抗病毒劑類注冊(cè)產(chǎn)品的測試標(biāo)準(zhǔn)和方法，用稀釋至使用濃度的消毒劑產(chǎn)品處理被病毒附著污染的物體表面，測定回收病毒的侵染能力，根據(jù)病毒侵染性的降低程度來證明消毒劑的抗病毒能力。

1? 試驗(yàn)方法

采用載體法獲得支持本研究結(jié)果的病毒學(xué)數(shù)據(jù)，該方法在美國官方分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）應(yīng)用稀釋法的基礎(chǔ)上稍作修改而成。

1.1 病毒體系

HPAI病毒由美國喬治亞洲亞特蘭大疾病控制中心的亞歷山大克里莫夫博士 （Alexander Klimov） 提供。病毒毒種為禽流感病毒 H5N1 亞型的A/VN/1203/2004株，培養(yǎng)于雞胚尿囊腔中。將病毒以1∶20的比例稀釋到濃度為5%的尿囊溶液中用作固體載荷。

1.2 侵染性測定（侵染性的指示劑、介質(zhì)、試劑和儀器）

將病毒接種于孵化9 d～11 d的長齡雞胚，以評(píng)估病毒的侵染能力。孵化? ? ? ? ? ?9 d～11 d長齡雞胚以無病原為特征，均由 Charles River 提供。雞胚運(yùn)達(dá)當(dāng)天記為孵化的第0天，然后置于孵化器中孵化。孵化器溫度保持在37 ℃左右，濕度為40%～70%。雞胚每3 h借助自動(dòng)旋轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)動(dòng)一次。

使用前，所有雞胚都進(jìn)行光照檢查，以確定其存活狀態(tài)。主要檢查雞胚的運(yùn)動(dòng)情況以及是否形成良好的血管系統(tǒng)。光照檢查時(shí)，如果雞胚沒有任何運(yùn)動(dòng)跡象，且血管系統(tǒng)被破壞，則可以認(rèn)為已經(jīng)死亡，使用前挑出死亡雞胚。接種前，在雞蛋頂部噴酒精，并用雞蛋打孔器開口，用配有1〞23 G鈍尖針頭的1 mL注射器接種。接種后，用膠水密封蛋殼開口。接種后的雞蛋不再轉(zhuǎn)動(dòng)。

在進(jìn)行侵染性測評(píng)時(shí)，每一份稀釋液接種4個(gè)雞胚。將0.2 mL待測液接種于雞胚的尿囊腔，孵化4 d。用雞胚的死亡情況表征病毒的侵染能力，并用Reed-Muench法計(jì)算50%雞胚致死量的滴度（ELD50）。

1.3 合成硬水

根據(jù)AOAC法的960.25條款E合成硬水。

1.4 試驗(yàn)材料

1.4.1 消毒劑的準(zhǔn)備

根據(jù)戊二醛產(chǎn)品應(yīng)用指導(dǎo)制備消毒劑。將定量的產(chǎn)品加入容量瓶中，用硬水定容至100 mL，產(chǎn)品的使用量和水的硬度如表1所示。所有待測液的濃度均以戊二醛活性濃度為基準(zhǔn)進(jìn)行制備。

1.4.2 病毒膜的制備

用HBSS平衡鹽溶液將病毒的尿囊溶液稀釋至5%。取0.2 mL該病毒接種物均勻噴灑在23 cm2～28 cm2的玻璃培養(yǎng)皿底部，空氣干燥形成病毒膜，用于待測產(chǎn)品的消毒性測定。

1.5 病毒對(duì)照膜的處理

加入2 mL的HBSS病毒對(duì)照膜，培養(yǎng) 5 min。此額外加入的2 mL HBSS將病毒稀釋10倍。經(jīng)過一定的接觸時(shí)間，加入2 mL中和劑（2×HBSS+50%胎牛血清），病毒被稀釋20倍。用移液管尖端來回刮擦培養(yǎng)皿表面數(shù)次，重懸病毒。其他的稀釋步驟均以1×HBSS為溶劑。重懸后，將病毒液以1∶5稀釋。因此，接種于雞胚中的第一個(gè)稀釋濃度為1∶100或表示為10-2，其余稀釋經(jīng)1∶10梯度稀釋獲得。至于對(duì)照病毒，其毒性對(duì)照和經(jīng)消毒劑樣品處理后的病毒均以相同方式處理。

1.6 中和

本試驗(yàn)采用稀釋法進(jìn)行中和，具體過程如下所述：經(jīng)過一定時(shí)間接觸后，取? ? ?2 mL的中和劑（2×HBSS+50%胎牛血清）加入對(duì)照病毒膜和消毒劑處理后的病毒膜，形成1∶2的稀釋，隨后盡快稀釋。加入中和劑后，用移液管尖端來回刮擦培養(yǎng)皿表面數(shù)次，重懸病毒。除開始加入中和劑外，其余所有稀釋均以1×HBSS為溶劑。

1.7 消毒劑雞胚毒性對(duì)照（使用不含病毒的5%尿囊液干燥膜）

對(duì)于每一批待測消毒劑，各取2 mL同樣濃度產(chǎn)品的稀釋液處理5%尿囊液膜，以此測評(píng)消毒劑對(duì)細(xì)胞的毒性效應(yīng)。以上述處理病毒對(duì)照膜和經(jīng)消毒劑處理后病毒膜相同的方法處理這些培養(yǎng)皿。按上述操作梯度稀釋這些中和后的模擬侵染液，與病毒對(duì)照和經(jīng)消毒處理的病毒樣品同步進(jìn)行雞胚毒性測定。

1.8 中和劑對(duì)照

取0.2 mL中和后產(chǎn)品毒性對(duì)照的每一稀釋梯度與等體積相應(yīng)的病毒對(duì)照稀釋液混合液，接種于雞胚以確定其效價(jià)。如果測試病毒的毒性效價(jià)小于對(duì)照病毒的效價(jià)，說明產(chǎn)品經(jīng)中和及稀釋后仍保持活性。應(yīng)從對(duì)照病毒的效價(jià)中減去中和對(duì)照的效價(jià)。從消毒劑處理后與對(duì)照病毒相比后效價(jià)的降低中減去由中和劑導(dǎo)致的效價(jià)降低，是消毒劑導(dǎo)致的病毒效價(jià)降低。由此來確定產(chǎn)品是否能夠?qū)⒉《拘r(jià)降低3log10。

1.9 檢測標(biāo)準(zhǔn)

測試結(jié)果有效要求：（a） 至少4log10的病毒侵染能力從干燥的對(duì)照病毒膜中恢復(fù);（b） 相較于對(duì)照組，測試產(chǎn)品至少可以使病毒效價(jià)降低3log10;（c） 在最低無毒稀釋液中未檢出病毒侵染性;（d） HBSS接種對(duì)照雞胚組仍然保持活性，且沒有可見的被侵染性跡象;（e） 未接種雞胚對(duì)照仍然存活。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（效價(jià)的計(jì)算）

病毒效價(jià)和產(chǎn)品本身的毒性效價(jià)以50%雞胚致死量的負(fù)對(duì)數(shù)值（-log10ELD50）和50%雞胚中毒劑量的負(fù)對(duì)數(shù)值（-log10TD50）表示，采用Reed-Muench法進(jìn)行計(jì)算。

1.11 測試系統(tǒng)的認(rèn)證過程

美國南方研究所始終堅(jiān)持執(zhí)行有關(guān)消毒劑效力測定的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（Standard Operating Procedures，SOPs）。SOPs涉及測試工作的諸多方面，其中包括：病毒和雞胚等生物制劑的購買發(fā)票、登記和追蹤，以備鑒定認(rèn)證;病毒稀釋溶劑等化學(xué)試劑的發(fā)票及使用，等等。這些程序的制定旨在記錄消毒劑效力測試研究的每一步。此外，培養(yǎng)皿、稀釋管、雞胚和雞胚托盤等均根據(jù)測試病毒、試驗(yàn)起始時(shí)間以及測試產(chǎn)品等進(jìn)行標(biāo)簽。這些方法旨在記錄確定測試系統(tǒng)。

2? 結(jié)果

測試產(chǎn)品的相關(guān)數(shù)據(jù)見表2。

1 000 mg/kg和500 mg/kg的格利特消毒劑稀釋液均可殺滅超過3log10的病毒量，在最低無毒稀釋液中未檢出存活的病毒。對(duì)照病毒的效價(jià)為105.3。在較高濃度的格利特消毒劑中，中和對(duì)照降低了病毒的（2log10）效價(jià)，說明加入中和劑和稀釋液后，產(chǎn)品依然具有活性。因此，經(jīng)? ? ? ?1 000 mg/kg的格利特消毒劑處理后，病毒效價(jià)的降低扣除中和劑引起的效價(jià)降低后達(dá)不到3log10，而在500 mg/kg濃度下，產(chǎn)品顯然可以達(dá)到降低3log10的滴定度并且在最低無毒稀釋濃度中無病毒殘留的要求。因此，1 000 mg/kg的濃度可以視為通過測試，因?yàn)?00 mg/kg的濃度可通過測試。

3? 結(jié)論

根據(jù)以上測試結(jié)果，可以做出以下結(jié)論：格利特消毒劑的1000 mg/kg稀釋液符合EPA標(biāo)準(zhǔn)，是抗病毒劑。