豬場(chǎng)環(huán)境中蒼蠅攜帶的PRRSV NSP2 及ORF5 基因遺傳特征差異性分析

馮曉慧 ，單栢強(qiáng) ，崔月娀 ，魏 澍 ，張 飛 ，沈國順 ，劉金玲

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽 110161；2.遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，沈陽 110164）

豬繁殖與呼吸綜合征 （porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS） 是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染引起的一種豬的全球性疫病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，以妊娠母豬和初生仔豬最易感[1-2]。 PRRSV 分兩種基因型：Lelystad virus 代表的歐洲型和VR2332代表的北美洲型， 兩者在核苷酸水平上有明顯的異性。 PRRSV 屬于Nidovitales、Arteriviridae 家族的Arterivirus屬，基因組片段長約 15 kb，包含 8 個(gè) ORFs，從 5’端到 3’端依次為 ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF 3-7 和新發(fā)現(xiàn)的ORF5a，其中ORF1a 和ORF1b 占基因組全長的2/3，ORF1a 和ORF1b 分別編碼多蛋白酶，pp1a 和pp1ab，參與病毒復(fù)制[3]。pp1a 可以產(chǎn)生至少 11 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，如 NSP1a、NSP1β、NSP2、NSP2 TF 等。ORF5-7 分別編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白GP5、M、N[4]。NSP2 編碼PRRSV 基因組中最大的非結(jié)構(gòu)蛋白。由N-端半胱氨酸蛋白酶、中間的高變區(qū)、C-端的跨膜區(qū)域、C-端末尾保守功能區(qū)域組成[5]。NSP2 在病毒復(fù)制中與NSP3 共同參與雙層膜泡結(jié)構(gòu)的形成[6-7]。GP5 蛋白是PRRSV 最主要的免疫原性蛋白，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體引起一系列細(xì)胞免疫反應(yīng)。此外，PRRSV 具有遺傳多樣性的特點(diǎn)，可通過突變、缺失、重組等方式產(chǎn)生新的致病性強(qiáng)的病毒[8-10]。 嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的健康生長。 ORF5 和NSP2 是PRRSV 基因組的高度可變區(qū)域， 可作為研究PRRSV 變異和遺傳多樣性的首選基因，歐洲型和美洲型ORF5 基因氨基酸同源性為55%，具有較高的差異。

易感豬可經(jīng)口、鼻腔、肌肉、腹腔、靜脈及子宮內(nèi)接種等多種途徑而感染PRRSV，從病豬的鼻腔、糞便及尿中均可檢測(cè)到病毒。 易感豬與帶毒豬直接接觸或與污染了PRRSV 的運(yùn)輸工具、器械接觸也可感染PRRS。 此外，國內(nèi)外學(xué)者在研究PRRSV 傳播途徑中發(fā)現(xiàn)，將赫眼家蠅和紅眼家蠅放入感染了PRRSV 的豬舍，重新捕獲、洗滌后通過RT-PCR 在蒼蠅樣品中檢測(cè)到了具有感染性的PRRSV[11]。 相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)，蒼蠅不僅能夠感染PRRSV，并且能夠攜帶PRRSV 傳播至1．7km 并傳染給易感豬。蒼蠅的飛行傳播恰好解釋了PRRSV 在農(nóng)場(chǎng)之間傳播具有季節(jié)性的特點(diǎn)[11-12]。 為了解媒介飛行昆蟲傳播病原的分子生物學(xué)特點(diǎn)，有效預(yù)測(cè)和控制疫情傳播，本試驗(yàn)通過收集PRRSV 陽性豬場(chǎng)環(huán)境中的蒼蠅和發(fā)病豬的淋巴結(jié)， 洗滌后分別提取核酸， 采用RT-PCR 方法， 檢測(cè)PRRSV NSP2、ORF5 基因，利用生物信息學(xué)軟件分析豬源和蒼蠅源PRRSV NSP2 和ORF5 基因的遺傳特性，比較二者間的差異，以期為初步評(píng)估環(huán)境飛行昆蟲媒介傳播PRRSV 的潛在風(fēng)險(xiǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

TrizoL 購自invitrogen 公司；CCL3、 無水乙醇購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司；DHPC 處理水購自北京索萊寶科技有限公司；瓊脂糖（APLHGHN CA94107）購自Gel 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A）購自Takara 寶生物工程（大連）有限公司等。

1.2 樣品采集

2018 年7～8 月選取8 個(gè)沈陽周邊PRRSV 陽性豬場(chǎng)，每個(gè)豬場(chǎng)采集PRRSV 病豬的淋巴結(jié)2～3 份，捕蠅器收集豬舍環(huán)境中的蒼蠅，每個(gè)豬場(chǎng)10～30 只蒼蠅樣本。

1.3 設(shè)計(jì)引物與合成

根據(jù)NCBI GenBank 登錄號(hào)的PRRSV 基因序列，采用Primer 軟件設(shè)計(jì)PRRSV NSP2（可區(qū)分高致病及低致病性毒株）和ORF5 基因特異性引物。 由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 PRRSV 的基因片段Table 1 PRRSV gene fragments

1.4 蒼蠅和豬淋巴組織RNA 的提取

取8～10 只經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定主要以腐生生活方式為主的舍蠅和適量豬場(chǎng)病豬淋巴組織，用生理鹽水反復(fù)清洗，分別用液氮研磨成粉沫， 置于1．5mL 除酶離心管， 加入1mL Trizol， 混勻靜置10min 后再加入200μL 氯仿靜置5min，4℃ 12000r·min-1離心 15min，吸取 400μL 上清水相放入新的 1．5mL 除酶離心管，再加入 500μL 異丙醇顛倒混勻，靜置 10min 后 4℃ 10000r·min-1離心 10min，棄上清后加 1mL 預(yù)冷的 75%無 RNase 乙醇，4℃ 8000r·min-1離心 5min，棄液體，加 20μL RNA 溶解水，測(cè)定濃度，-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 蒼蠅和豬淋巴組織中PRRSV 的RT-PCR

為保證上樣模板量的一致性，將測(cè)完濃度的蒼蠅源和豬源RNA 樣本稀釋至相同濃度，參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作流程制備 cDNA：去除混有的 DNA 后依次加入 Random hexamers 1 μL，2×RT Mix 10μL，Oligo（dT）23VN 1μL，Hiscript Ⅱ Hnzyme Mix 2μL，RNA 模版為含 1 μg 總 RNA 對(duì)應(yīng)體積，RNase free dd H2O 添加至 20μL。 25℃ 5min、50℃ 45min、85℃ 2min 反應(yīng)后-20℃保存。

PCR 反應(yīng)：取蒼蠅源和豬源 cDNA 模板各 1μL，分別依次加入上下游引物各 0．4μL，RNase free ddH2O 3．2μL，HxTaqDNA 酶 5μL，總體積為 10μL。 PRRSV NSP2 基因擴(kuò)增條件：94℃預(yù)熱 2min 后按 94℃ 30s，54℃ 30s，72℃30s，擴(kuò)增 30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 2min。 PRRSV ORF5 基因擴(kuò)增條件：94℃預(yù)熱 2min 后按 94℃ 30s；55℃ 30s；72℃30s；擴(kuò)增 30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 2min。PRRSV ORF5 基因套式 PCR 擴(kuò)增條件：以蒼蠅源 PRRSV 的 ORF5 第一次RT-PCR 產(chǎn)物為模板，進(jìn)行二次RT-PCR，反應(yīng)體系同上。1%瓊脂糖凝膠電泳后在紫外光下觀察目的基因條帶。

1.6 蒼蠅和豬淋巴組織中PRRSV NSP2 和ORF5 基因序列測(cè)定及生物信息學(xué)分析

將蒼蠅源和豬源PRRSV 的NSP2 和ORF5 基因的RT-PCR 產(chǎn)物送上海生工測(cè)序。 運(yùn)用DNASTAR、Fig tree、MHGA 等生物信息軟件將獲得的PRRSV NSP2 和ORF5 基因序列與GenBank 登陸的PRRSV 代表毒株進(jìn)行核苷酸、氨基酸序列的同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒼蠅和豬淋巴組織PRRSV NSP2 和ORF5 基因的RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果

采用1．0%瓊脂糖凝膠對(duì)蒼蠅源和豬源PRRSV 的NSP2 和ORF5 基因RT-PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳， 在凝膠成像系統(tǒng)中檢測(cè)。 結(jié)果表明，豬源和蒼蠅源PRRSV 的NSP2 基因產(chǎn)物均在250bp 出現(xiàn)目的片段， 蒼蠅源和豬源PRRSV的ORF5 基因套式PCR 產(chǎn)物分別在258bp 和385bp 出現(xiàn)目的片段，與預(yù)期片段長度一致（圖1）。

2.2 蒼蠅源PRRSV 與豬源以及其他PRRSV 代表株的NSP2 和ORF5 基因核苷酸與氨基酸同源性分析

采用DNAStar 軟件對(duì)蒼蠅源PRRSV 與豬場(chǎng)豬源以及其他PRRSV 代表株的NSP2 和ORF5 基因分別進(jìn)行核苷酸與氨基酸序列分析。 結(jié)果表明，蒼蠅源PRRSV NSP2 基因與豬源以及其他PRRSV 代表株的NSP2 基因核苷酸同源性為 45．9%～95．9%，氨基酸同源性為 33%～92．9%。 蒼蠅源PRRSV ORF5 基因與豬源以及其他 PRRSV 代表株ORF5 基因核苷酸同源性為 61．5%～95．2%， 氨基酸同源性為 32．5%～90．9%。 綜上表明，蒼蠅源 PRRSV 與豬源以及其他PRRSV 代表株的NSP2 和ORF5 基因在核苷酸和氨基酸序列上均存在不同程度的差異。 其中蒼蠅源PRRSV NSP2 基因與PRRSV VR2332 代表株核苷酸的差異最大，同源性為45．9%，與豬場(chǎng)豬源PRRSV 的差異最小，二者同源性為95．9%，其次是PRRSV GD 代表株為93．9%。 此外，蒼蠅源PRRSV NSP2 基因與PRRSV LV 代表株氨基酸同源性最低為33%，與豬場(chǎng)豬源PRRSV 同源性為92．9%。 另一方面，蒼蠅源PRRSV ORF5 基因與PRRSV LV 代表株核苷酸同源性最低為61．5%，與PRRSV GX1003、15SC1、GD 代表株的同源性為94．8%，并且與PRRSVHurope 代表株氨基酸序列差異最大，同源性僅為為32．5%，與PRRSV GD 代表株的差異最小同源性為90．9%(圖2)。

圖1 蒼蠅源和豬場(chǎng)豬源PRRSV NSP2 和ORF5 基因RT-PCR 產(chǎn)物電泳分析圖Figure 1 RT-PCR electrophoresis maps of PRRSV NSP2 and ORF5 genes from flies and pigs in the farms

圖2 蒼蠅源、豬場(chǎng)豬源和其他PRRSV 代表株 NSP2、ORF5 基因序列同源性分析Figure 2 Homology analysis of NSP2 and ORF5 genes of PRRSV from flies , pigs and the other representative strains

2.3 蒼蠅源PRRSV 與豬源以及其他PRRSV 代表株NSP2 和ORF5 基因差異氨基酸位點(diǎn)分析

蒼蠅源PRRSV 與豬場(chǎng)豬源以及其他PRRSV 代表株NSP2 基因編碼的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明， 蒼蠅源PRRSV 的NSP2 基因在第472 位氨基酸存在缺失，第529 位發(fā)生529Arg→Lys 替換；與其他PRRSV 代表株SH1-GD、ZJ2、FZ06A、Hanvet1．vn、HNxa14 相比，蒼蠅源和豬場(chǎng)豬源 PRRSV 的 NSP2 基因均在第 469 位氨基酸插入 1個(gè)Met，其余氨基酸序列與PRRSV 代表株一致，同樣在480-481 位氨基酸出現(xiàn)缺失(圖3)。

圖3 蒼蠅源豬場(chǎng)豬源以及其他PRRSV 代表株NSP2 基因氨基酸差異位點(diǎn)分析Figure 3 Different site analysis of amino acid for PRRSV NSP2 genes from flies, pigs and the other representative strains

蒼蠅源PRRSV 與豬場(chǎng)豬源以及其他PRRSV 代表株的ORF5 基因編碼的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，蒼蠅源PRRSV ORF5 基因的第 16，20，92 位氨基酸缺失，第 33，59，88，90 位氨基酸分別出現(xiàn) 33Asp→Asn、59Asn→Lys、88Pro→Leu、90His→Arg 替換，第 82 位有 1 個(gè) Leu 的插入。而豬場(chǎng)豬源 PRRSV ORF5 基因與其他 PRRSV 代表株GX1001、Hanvet1．vn、JXA1P160 僅在第 16 位氨基酸出現(xiàn) 16Phe→Ser 的替換，其他氨基酸序列一致，未發(fā)生變異（圖4）。 綜上結(jié)果表明，蒼蠅源與豬場(chǎng)豬源以及PRRSV 代表株的NSP2 和ORF5 基因之間存在多個(gè)氨基酸位點(diǎn)的替換和缺失， 且蒼蠅源PRRSV 與豬場(chǎng)豬源以及其他PRRSV 代表株的ORF5 基因氨基酸變異位點(diǎn)多于NSP2基因，而豬場(chǎng)豬源的NSP2 和ORF5 基因和其他PRRSV 代表株之間未見明顯差異。

圖4 蒼蠅源與豬場(chǎng)豬源以及其他PRRSV 代表株 ORF5 基因氨基酸差異位點(diǎn)分析Figure 4 Different site analysis of amino acid for PRRS VORF5 genes from flies, pigs and the representative strains

2.4 蒼蠅源與豬場(chǎng)豬源以及其他PRRSV 代表株NSP2 和ORF5 基因遺傳進(jìn)化樹分析

采用Fig tree、MHGA 生物信息軟件分別對(duì)蒼蠅源與豬場(chǎng)豬源以及其他代表株P(guān)RRSV 的NSP2 和ORF5 基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹分析。 結(jié)果表明，蒼蠅源PRRSV 的NSP2 和ORF5 基因與高致病性PRRSV GD 株的親緣關(guān)系較近，而豬場(chǎng)豬源PRRSV 的NSP2 和ORF5 基因與PRRSV NVDC 株的親緣關(guān)系較近，說明蒼蠅源PRRSV 與本豬場(chǎng)豬源PRRSV 可能來源于不同的毒株， 這是否與蒼蠅在不同區(qū)域飛行機(jī)械傳播的特性具有相關(guān)性需要進(jìn)一步的研究，但無論是蒼蠅還是豬場(chǎng)豬源PRRSV 的NSP2 和ORF5 基因均屬于美洲基因型分支，與歐洲基因型代表株Huro PRRSV 和Lelystadvirus 不在一個(gè)分支（圖5）。

圖5 蒼蠅源與豬源以及其他PRRSV 代表株的NSP2 和ORF5 基因遺傳進(jìn)化樹分析Figure 5 Phylogenetic tree analysis of PRRSV NSP2 and ORF5 genes from flies, pigs and other PRRSV representative strains

3 討論與結(jié)論

PRRS 是能夠引起母豬繁殖障礙及仔豬呼吸系統(tǒng)疾病的高度致死性傳染病， 是嚴(yán)重威脅全世界養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的豬的主要疫病之一。我國自1996 年首次報(bào)道以來目前PRRS 已遍布全國。PRRSV 具有變異性和多樣性，遺傳變異的結(jié)果可以導(dǎo)致PRRSV 的某些生物學(xué)特性發(fā)生改變。 我國2006 年4 月發(fā)生的“豬高熱病”也是由于PRRSV NSP2 基因缺失30 多個(gè)氨基酸變異成高致病性PRRSV， 更是造成了高達(dá)數(shù)千億元人民幣的經(jīng)濟(jì)損失[13-14]。 2010 年從白俄羅斯分離的“麗娜”為新型變異的PRRSV，屬于第3 種基因亞型的PRRSV，可導(dǎo)致40%的仔豬死亡。 此外，新毒株的流行也極易造成PRRS 的大面積爆發(fā)[15]。 豬是PRRSV 的自然感染宿主，感染豬、公豬精液、污染的用具和車輛等均為傳染源[16]，而國外學(xué)者在研究PRRSV 傳播途徑時(shí)在其他生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了PRRSV，進(jìn)而證實(shí)了家蠅和刺擾伊蚊等媒介可傳播或攜帶該病毒[17-18]。 本研究以此為切入點(diǎn)，分析蒼蠅源與豬場(chǎng)豬源以及其他PRRSV 代表株的基因遺傳變異特性， 從而探討飛行蟲媒在傳播PRRSV 中的作用，為初步評(píng)估環(huán)境中生物媒介傳播PRRSV 的潛在風(fēng)險(xiǎn)提供了理論依據(jù)，這對(duì)PRRSV 傳播途徑的研究及評(píng)價(jià)公共衛(wèi)生具有重要意義。

檢測(cè)結(jié)果表明，蒼蠅源PRRSV NSP2 基因與豬場(chǎng)豬源及其他PRRSV 代表株的NSP2 基因核苷酸的同源性為45．9%～95．9%， 氨基酸同源性為 33%～92．9%。 而蒼蠅源 PRRSV ORF5 基因與豬場(chǎng)豬源及其他 PRRSV 代表株的ORF5 基因核苷酸的同源性為 61．5%～95．2%，氨基酸同源性為 32．5%～90．9%。 進(jìn)一步的序列分析結(jié)果顯示蒼蠅源PRRSV NSP2 和ORF5 基因的氨基酸位點(diǎn)存在多個(gè)位點(diǎn)的替換和缺失。 表明蒼蠅源PRRSV NSP2 和ORF5 基因與豬場(chǎng)豬源及其他PRRSV 代表株相應(yīng)的基因均存在不同程度的位點(diǎn)差異。 從進(jìn)化樹的關(guān)系來看蒼蠅源與豬源豬場(chǎng)PRRSV 同屬美洲群分支，但二者分別與PRRSV GD 株和NVDC 株同源關(guān)系最近，初步推測(cè)蒼蠅源和豬場(chǎng)豬源PRRSV 可能來源于不同的PRRSV 毒株，這是否與蒼蠅在不同區(qū)域飛行機(jī)械傳播的特性具有相關(guān)性需要進(jìn)一步的研究。 此外在本研究中，采集了8 家PRRSV 感染豬場(chǎng)環(huán)境中的蒼蠅和病豬淋巴結(jié)樣本，雖然并不是從所有感染豬場(chǎng)的蒼蠅樣本中檢測(cè)到了PRRSV， 但對(duì)PRRSV 陽性的蒼蠅樣本同時(shí)開展了包括PRRSV NSP2 和ORF5 基因在內(nèi)的多個(gè)基因的多次RT-PCR 檢測(cè)。測(cè)序結(jié)果均表明，蒼蠅源和豬場(chǎng)豬源PRRSV 的NSP2 和ORF5基因高變區(qū)變化程度相對(duì)PRRSV 的其他基因較明顯（其他相關(guān)基因的數(shù)據(jù)會(huì)在后續(xù)研究中發(fā)表NSP2。 結(jié)合相關(guān)資料初步分析認(rèn)為，PRRSV 的NSP2 和ORF5 為PRRSV 易變異基因，非保守基因，其變異頻率本就高于其他基因[19-20]，而本研究是將收集的蒼蠅樣本反復(fù)沖洗后取其腹部采用RT-PCR 檢測(cè)PRRSV 基因，所以蒼蠅源的PRRSV 主要來源于蒼蠅內(nèi)部，雖然此前報(bào)道在蒼蠅體內(nèi)同樣檢測(cè)到PRRSV[11]，但畢竟蒼蠅并不是PRRSV 易感的生物宿主，這種非宿主生物體內(nèi)環(huán)境可能促進(jìn)了NSP2 和ORF5 基因變化的頻率[20-21]，而且PRRSV 在其非易感宿主內(nèi)不能高效率復(fù)制， 導(dǎo)致病毒載量的降低， 本研究采用套式PCR 方法才檢測(cè)到了蒼蠅源PRRSV ORF5 基因，也正好驗(yàn)證了初步推測(cè)。然而，蒼蠅源PRRSV 基因的這種變異是否會(huì)引起PRRSV 生物學(xué)特性的改變目前還不清楚， 重要的是PRRSV 基因在自然環(huán)境和蒼蠅體內(nèi)的變異特性與蒼蠅等飛行媒介攜帶并傳播病原特性的雙重結(jié)合，是否會(huì)給公共衛(wèi)生安全帶來潛在危險(xiǎn)，是值得進(jìn)一步思考的問題。 因?yàn)闆]有從蒼蠅體內(nèi)分離PRRSV，并且本研究中的蒼蠅主要是以腐生方式為主的舍蠅，因此，不能夠確定蒼蠅源PRRSV 是來自于蒼蠅的體外攜帶還是吸入了PRRSV 污染的食物。 在后續(xù)研究中，會(huì)繼續(xù)開展從蒼蠅體內(nèi)分離PRRSV，進(jìn)一步了解蒼蠅源PRRSV的生物學(xué)特性，為全面分析比較蒼蠅源和豬源PRRSV 的差異特點(diǎn)提供理論依據(jù)。 綜上，蒼蠅源和豬場(chǎng)豬源以及PRRSV 代表株的NSP2 和ORF5 基因存在不同程度的差異，為飛行昆蟲媒介傳播病原的潛在風(fēng)險(xiǎn)提供初步評(píng)估指標(biāo)，也為進(jìn)一步研究其傳播途徑、分子流行病學(xué)及毒株之間的種系進(jìn)化關(guān)系等提供重要的理論參考依據(jù)。