間接血凝試驗(yàn)（IHA）應(yīng)用于牛血吸蟲(chóng)病診斷效果的觀察

劉雪芹

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院山東濰坊 261000）

間接血凝試驗(yàn)自20世紀(jì)50年代末引入我國(guó)，是典型的利用抗原檢測(cè)抗體的特異性反應(yīng)，因其技術(shù)包容性強(qiáng)，制備工藝相對(duì)簡(jiǎn)單，且具備較高敏感性和較好的重復(fù)性，很快應(yīng)用于多種疾病的診斷，并研發(fā)出一系列的疾病檢測(cè)試劑盒[1]。20世紀(jì)80年代初，基于純化抗原致敏紅血球診斷牛血吸蟲(chóng)病的間接血凝試劑盒被開(kāi)發(fā)出來(lái)，并在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行初步驗(yàn)證。雖然技術(shù)相對(duì)成熟，但基于當(dāng)時(shí)我國(guó)家畜血吸蟲(chóng)病較重的流行程度使病原學(xué)敏感性較差的弊端不易暴露，間接血凝試驗(yàn)在家畜血吸蟲(chóng)病診斷方面發(fā)展不溫不火，也沒(méi)有在基層畜牧站廣泛推廣?，F(xiàn)今基層站點(diǎn)仍然使用較為經(jīng)典、傳統(tǒng)的血吸蟲(chóng)毛蚴糞便孵化法進(jìn)行診斷。雖我國(guó)流行區(qū)耕牛存欄量大幅度減少，但逐頭糞檢工作量仍較大，且流行程度降低使不敏感的弊端暴露。本文應(yīng)用基于間接血凝試驗(yàn)的試劑盒進(jìn)行全縣牛的篩查，并和糞便毛蚴孵化法進(jìn)行對(duì)比，以期推進(jìn)基層畜牧獸醫(yī)站技術(shù)的更新，更好推動(dòng)以牛為主要的傳染源管控。

1 間接血凝試驗(yàn)原理

將日本血吸蟲(chóng)可溶性蟲(chóng)卵抗原（SEA）或其他日本血吸蟲(chóng)抗原吸附于紅細(xì)胞載體上，使其成為致敏紅細(xì)胞。致敏紅細(xì)胞遇到家畜血清中相應(yīng)的抗體，在適宜溫度下，紅細(xì)胞表面的抗原和特異性抗體相結(jié)合，形成肉眼可見(jiàn)的紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。依據(jù)此原理制成的間接血凝檢測(cè)試劑盒包括凍干致敏紅細(xì)胞、稀釋液、陰陽(yáng)性對(duì)照品，試劑盒可常溫運(yùn)輸，4℃保存。

2 診斷樣本的采集與處理

將牛保定，采集牛頸靜脈或耳部靜脈全血。將采集的全血放置4℃30min后拿出，簡(jiǎn)短離心或直接吸取血清并編號(hào)。如果血清分離后并未立即開(kāi)始檢測(cè)，血清放置-20℃保存。采集相應(yīng)牛糞便，大約100～150g，采集的牛糞便不宜放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，2d之內(nèi)檢測(cè)完成。

3 樣本的檢測(cè)及結(jié)果

3.1 間接血凝試驗(yàn)檢測(cè)

取試劑盒樣本稀釋液將凍干致敏紅細(xì)胞稀釋，充分混勻待用。于血凝板第1列第1孔加稀釋液100μL，第2～4孔各加稀釋液25μL，第1孔中加待測(cè)血清25μL，充分混勻棄去75μL后吸出25μL于第2孔，第2孔充分混勻后吸出25μL于第3孔，重復(fù)上述步驟至第4孔，血清稀釋比例依次為1：5，1：10，1：20和1：40。每孔加25μL紅細(xì)胞懸液，輕微振蕩1～2min，37℃，30min觀察結(jié)果。每次試驗(yàn)設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照，且以稀釋度1：10作為判定是否陽(yáng)性的閾值（陰性：紅細(xì)胞全部下沉在孔底形成小圓點(diǎn)；陽(yáng)性：紅細(xì)胞無(wú)下沉或部分下沉，形成薄層凝集）[1]。

3.2 糞便毛蚴孵化法

將糞便置于60目的銅篩中，銅篩下罩一300目尼龍絹網(wǎng)兜，反復(fù)攪拌沖洗。將尼龍網(wǎng)兜中收集的洗脫沉渣置于頂管杯中，并用去氯水沖洗網(wǎng)兜于頂管杯中，蓋上頂管杯的頂蓋后加水至微微溢出，將玻璃頂管加滿水并開(kāi)口處蒙上一層薄棉花后插入頂管杯蓋中，避免出現(xiàn)氣泡。將頂管杯置于37℃光照條件下，1h后開(kāi)始肉眼觀察，發(fā)現(xiàn)毛蚴判定為陽(yáng)性。

3.3 檢測(cè)結(jié)果

本次調(diào)查同時(shí)使用IHA和糞便毛蚴孵化法對(duì)全縣范圍內(nèi)4,290頭牛進(jìn)行檢測(cè)，其中IHA檢測(cè)陽(yáng)性22頭，陽(yáng)性率0.51%，糞便毛蚴孵化法檢測(cè)陽(yáng)性0頭。

4 處置措施

對(duì)IHA檢測(cè)陽(yáng)性的牛再次采集并保存150g左右糞便，于第2d利用糞便毛蚴孵化法進(jìn)行一糞三檢復(fù)核，觀察其是否為病原學(xué)陽(yáng)性。另外，對(duì)于IHA陽(yáng)性檢測(cè)牛利用吡喹酮藥物給予治療，同飼養(yǎng)的牛群可進(jìn)行擴(kuò)大藥物化療。

5 討論

血吸蟲(chóng)病作為我國(guó)法定乙類傳染病，是我國(guó)重點(diǎn)防治的傳染病之一。進(jìn)入新世紀(jì)以來(lái)，我國(guó)實(shí)施以控制傳染源為主的綜合防治策略，我國(guó)血吸蟲(chóng)病流行進(jìn)一步降低并逐漸走向消除，近年“精準(zhǔn)”防治在流行病區(qū)提出[2]。病原學(xué)診斷是血吸蟲(chóng)病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，隨著流行程度的降低造成病原學(xué)診斷技術(shù)的敏感性降低，但由于糞便樣本采集方便，家畜血吸蟲(chóng)病直至近年仍較多采用毛蚴孵化法。較多基層防疫或疫控部門處于新老更替，新進(jìn)職工辨別血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵和毛蚴的能力有待提升，且多年未見(jiàn)陽(yáng)性糞便使得培訓(xùn)難度加大，不利于篩查出傳染源并給予相應(yīng)處置措施。IHA檢測(cè)技術(shù)已在人群血吸蟲(chóng)病篩查中大規(guī)模應(yīng)用多年，顯示出良好應(yīng)用成效，在人群中接受程度同樣較好。血清學(xué)檢測(cè)具有較高的敏感性，將IHA應(yīng)用于家畜初步篩查，陽(yáng)性后再給予糞檢復(fù)核非常必要且可行，且IHA操作簡(jiǎn)單，培訓(xùn)后易于上手，適合在基層家畜血防站或疫病控制系統(tǒng)使用[3]，但家畜全血的采集需要進(jìn)行相應(yīng)的培訓(xùn)。此外，應(yīng)用糞便孵化等病原學(xué)診斷技術(shù)，短時(shí)間完成大批量家畜檢測(cè)需要投入大量的人力和物力，而1～2名檢驗(yàn)人員使用IHA技術(shù)可在1d之內(nèi)完成對(duì)大批量動(dòng)物血清檢測(cè)。病原學(xué)陽(yáng)性家畜是我國(guó)血吸蟲(chóng)病達(dá)標(biāo)考核的重要內(nèi)容，傳播阻斷達(dá)標(biāo)，不能出現(xiàn)病原學(xué)陽(yáng)性家畜，這需要在每年常規(guī)篩查中應(yīng)用更敏感的診斷技術(shù)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并處置。本次篩查結(jié)果顯示IHA技術(shù)具有較好敏感性，適合對(duì)家畜進(jìn)行初步篩查，可在基層家畜血吸蟲(chóng)病防治部門大規(guī)模應(yīng)用。