基于光聲光譜深度掃描的單粒玉米種子發(fā)芽率無(wú)損檢測(cè)方法

王新宇，牛鵬帥，盧 偉，DENG Yiming

(1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 人工智能學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代設(shè)施農(nóng)業(yè)技術(shù)與裝備工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210031；2 密歇根州立大學(xué) 工學(xué)院，密歇根州 東蘭辛 48824)

美國(guó)農(nóng)業(yè)部2020年6月發(fā)布2020—2021年度全球玉米產(chǎn)量預(yù)估報(bào)告，我國(guó)以2.6億t的預(yù)估產(chǎn)量位居全球第2。玉米作為我國(guó)主要農(nóng)作物之一，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)，其種子質(zhì)量直接影響玉米產(chǎn)量，其中種子發(fā)芽率是評(píng)價(jià)種子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[1]。為避免因種子發(fā)芽率過(guò)低導(dǎo)致產(chǎn)量受損，需在播種前對(duì)隨機(jī)抽取的玉米種子進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)以確定發(fā)芽率，但該方法耗時(shí)較長(zhǎng)且受休眠期影響。為縮短檢測(cè)時(shí)間，染色法代替了發(fā)芽試驗(yàn)法，有活力種子胚細(xì)胞中的脫氫酶被染色劑(TTC)還原，胚部位呈紅色，以此區(qū)分有無(wú)活力的種子。染色法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確可靠，同時(shí)適用于休眠期長(zhǎng)和難以進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)的種子，但仍為有損檢測(cè)且對(duì)操作者專(zhuān)業(yè)性要求較高[2]。因此，1995年國(guó)際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)的《種子生活力測(cè)定手冊(cè)》提出電導(dǎo)率檢測(cè)方法[3]，在保證檢測(cè)速度的同時(shí)，降低了對(duì)操作人員的要求，但其主要基于種子吸脹初期細(xì)胞膜損傷重建過(guò)程中電解質(zhì)和可溶性物質(zhì)的外滲程度，對(duì)種子發(fā)芽率進(jìn)行評(píng)價(jià)，耗時(shí)較長(zhǎng)且損傷種子，同時(shí)準(zhǔn)確性也易受室溫、水溫、水質(zhì)等因素影響。

為實(shí)現(xiàn)玉米種子發(fā)芽率的快速無(wú)損檢測(cè)，近年來(lái)，機(jī)器視覺(jué)、近紅外光譜、高光譜成像等多種無(wú)損檢測(cè)技術(shù)被應(yīng)用于種子質(zhì)量評(píng)價(jià)。為準(zhǔn)確檢測(cè)玉米種子是否有機(jī)械損傷裂紋，閆彬等[4]基于機(jī)器視覺(jué)技術(shù)對(duì)自動(dòng)提取的320幅玉米胚面和胚乳面圖像裂紋進(jìn)行識(shí)別，準(zhǔn)確率分別為94.4%和86.9%。Kusumaningrum等[5]采用近紅外光譜技術(shù)并結(jié)合偏最小二乘法判別區(qū)分有無(wú)活力的大豆種子，精確度接近100%。Kimuli等[6]采用可見(jiàn)/近紅外高光譜成像系統(tǒng)對(duì)不同地區(qū)的4個(gè)品種的玉米種子表面是否含黃曲霉毒素B1進(jìn)行評(píng)估，結(jié)合主成分分析和因子判別分析建模，評(píng)估準(zhǔn)確率達(dá)到96%。Feng等[7]利用高光譜成像技術(shù)，通過(guò)圖譜融合鑒定不同加速老化時(shí)期的玉米種子活力，通過(guò)發(fā)芽試驗(yàn)驗(yàn)證分類(lèi)模型，其結(jié)果表明，高光譜技術(shù)結(jié)合SVM模型可以進(jìn)一步提高玉米種子活力的檢測(cè)精度?？梢?jiàn)，檢測(cè)信息維度的增加有利于提高檢測(cè)精度。本文擬通過(guò)深度掃描光聲光譜技術(shù)將光譜技術(shù)拓展到光譜、聲音、深度維度，基于此，構(gòu)建玉米種子發(fā)芽率預(yù)測(cè)模型，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同顏色玉米種子發(fā)芽率的快速、無(wú)損、高精度檢測(cè)，為種子質(zhì)量評(píng)估提供新的方法和技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取3種顏色、6個(gè)品種的玉米種子為研究對(duì)象，其中每種顏色的玉米種子均有2個(gè)不同的品種，分別為白玉米(‘銀香’和‘京糯808’)，黃玉米(‘京黏1號(hào)’和‘蘇玉’)，黑玉米(‘黑糯4號(hào)’和‘黑糯6號(hào)’)，于2019年收獲于山東濰坊，由壽光順昌種業(yè)提供，經(jīng)篩選剔除缺陷種子，每個(gè)品種挑選顆粒飽滿、外表無(wú)明顯差異的種子1 600粒，用于人工老化。

1.2 人工老化

為得到不同發(fā)芽率的玉米種子，參照已有研究[8]采用人工老化法對(duì)玉米種子樣品進(jìn)行高溫高濕人工老化處理。將挑選的種子均分為8份，按照0～7次序編號(hào)，將0～7號(hào)樣品置于托盤(pán)中放入培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠制造，型號(hào)：RXZ-128A)在溫度45 ℃和相對(duì)濕度95%環(huán)境下分別老化0、1、2、3、4、5、6和7 d。結(jié)束后從培養(yǎng)箱中取出，自然條件下風(fēng)干1 d后裝入密封袋中，放入4 ℃冰箱冷藏保存。

1.3 檢測(cè)原理

光聲光譜技術(shù)(Photoacoustic spectrometry technology, PAS)是一種基于光熱測(cè)量原理的新型技術(shù)，與傳統(tǒng)吸收光譜的測(cè)量原理差異在于，PAS并非基于光子特性直接進(jìn)行光譜檢測(cè)，而是在樣品受光照之后，對(duì)其在無(wú)輻射激發(fā)現(xiàn)象中的周期性熱流進(jìn)行檢測(cè)。在不同光譜波長(zhǎng)和調(diào)制頻率下，不同材料中的熱擴(kuò)散長(zhǎng)度具有差異，因此，可通過(guò)物質(zhì)表面附近熱擴(kuò)散層內(nèi)的光吸收進(jìn)行物質(zhì)成分分析。隨著調(diào)制頻率的降低，熱擴(kuò)散距離增加，檢測(cè)深度更深，基于此原理可以檢測(cè)樣品不同深度的物質(zhì)成分[9]。由于玉米種子的種皮具有良好的透光性，而胚乳、子葉、胚芽、胚軸和胚根的老化程度和種子生命活力具有密切的聯(lián)系，因此通過(guò)深度掃描光聲光譜可挖掘出玉米種子的生命信息[10]，原理如圖1所示。

圖1 玉米種子光聲光譜深度掃描原理Fig. 1 Photoacoustic spectroscopy deep scan schematic diagram of maize seed

1.4 光聲光譜采集

試驗(yàn)使用美國(guó)Thermal Fish公司生產(chǎn)的Nicolet Is50R 紅外光譜儀和美國(guó)MTEC Photoacoustics公司生產(chǎn)的PA300光聲檢測(cè)器搭建玉米種子光聲光譜檢測(cè)系統(tǒng)。在試驗(yàn)數(shù)據(jù)采集之前，將光譜儀開(kāi)機(jī)預(yù)熱0.5 h，并用氮?dú)鈱?duì)整個(gè)紅外光譜儀倉(cāng)體內(nèi)部進(jìn)行吹掃，以減小水分對(duì)光譜測(cè)定的干擾，然后對(duì)光譜儀進(jìn)行設(shè)定。試驗(yàn)過(guò)程中掃描的光聲光譜波數(shù)范圍為中紅外400～4 000 cm－1，光譜掃描的分辨率為8 cm－1，動(dòng)鏡速率為0.32 cm/s，光譜的連續(xù)掃描次數(shù)為32次。把不同老化程度的玉米樣品以單顆形式均勻放置在銅質(zhì)圓柱形樣品池(直徑10 mm，高5 mm)中，調(diào)整樣品的高度，使其低于樣品倉(cāng)邊緣 1～2 mm，用氦氣 (5 mL·min－1)連續(xù)吹掃10 s后采集樣品的光聲光譜，每改變一次采集深度前需重新用玻璃碳進(jìn)行一次相位校準(zhǔn)，以碳黑背景光譜作為對(duì)照，用于光譜信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)化處理。檢測(cè)裝置如圖2所示。

1.5 發(fā)芽試驗(yàn)

圖2 光聲光譜采集試驗(yàn)裝置示意圖Fig. 2 Schematic diagram of photoacoustic spectrum acquisition experimental device

經(jīng)過(guò)人工加速老化處理和光譜采集后，取不同老化處理時(shí)間的玉米種子各200粒，均分為4組，進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。試驗(yàn)過(guò)程中首先將不同老化時(shí)間的玉米種子按編號(hào)放入裝有清水的500 mL燒杯中，在20 ℃恒溫條件下浸種48 h。然后，將不同老化時(shí)間的玉米種子按編號(hào)順序依次放置在內(nèi)鋪2層濾紙的玻璃培養(yǎng)皿的相應(yīng)位置，加水濕潤(rùn)，每粒玉米種子之間留有種子直徑5倍以上的間距，蓋好蓋子后放入20 ℃的智能人工氣候箱(型號(hào)：RXZ型-多段編程，寧波江南儀器廠)中，按照GB/T 3543.4—1995農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程 發(fā)芽試驗(yàn)[11]要求培養(yǎng)玉米種子7 d。每天記錄玉米種子的發(fā)芽情況，第7天計(jì)算發(fā)芽率，結(jié)果取4組試驗(yàn)的平均值。發(fā)芽率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同老化時(shí)間玉米種子的發(fā)芽率Table 1 Germination rates of maize seeds with different aging times %

2 結(jié)果與分析

2.1 EEMD去噪

通過(guò)集合經(jīng)驗(yàn)?zāi)B(tài)分解(Ensemble empirical mode decomposition, EEMD)對(duì)采集到的原始光譜信息進(jìn)行去噪，得到平滑的原始光譜曲線[12]。步驟如下：

1)在原始光譜曲線x(t)中引入正態(tài)分布的白噪聲w(t)；

2)加入白噪聲的光譜作為一個(gè)新的光譜曲線X(t)=x(t)+w(t)，對(duì)構(gòu)造的新光譜曲線X(t)進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)?zāi)B(tài)分解，得到各個(gè)本征模函數(shù)(Intrinsic mode function, IMF)分量：

式中，cj是經(jīng)驗(yàn)?zāi)B(tài)分解得到的第j個(gè)IMF，rn是分解刪除n個(gè)IMF后的殘余分量，常表示信號(hào)趨勢(shì)；

3)給原始光譜曲線x(t)加入不同的白噪聲wi(t)，重復(fù)以上步驟得到各自分解后的IMF分量組：

式中，X(i)是加入白噪聲wi(t)后的光譜，cij是經(jīng)驗(yàn)?zāi)B(tài)分解得到的第j個(gè)IMF，rin是分解刪除n個(gè)IMF后的殘余分量；

4)每次獲得的IMF集合平均后作為最終的IMF：

式中，N為添加噪聲的次數(shù)。

以‘京黏1號(hào)’玉米為例，由于Nicolet Is50R紅外光譜儀的測(cè)量波數(shù)范圍(4 000～3 700 cm－1和940～400 cm－1)內(nèi)的信噪比過(guò)低，因此去除該段波數(shù)。圖3為該玉米種子在調(diào)制頻率為500 Hz下的光聲光譜原始圖像和EEMD去噪圖像。

圖3 ‘京黏1號(hào)’玉米的500 Hz (8 μm)原始圖像和去噪圖像Fig. 3 ‘Jingnian No.1’ maize original image and denoised image at 500 Hz (8 μm)

由圖4可見(jiàn)，不同老化程度的玉米種子在波數(shù)3 700～940 cm－1之間具有相似的吸收特性，出現(xiàn)相似度較強(qiáng)的吸收峰。在波數(shù)3 500～3 100 cm－1處有較寬吸收峰；在波數(shù)3 000～2 850 cm－1處均出現(xiàn)一尖峰；在2 700～1 850 cm－1范圍內(nèi)，光聲光譜信號(hào)較平緩，僅在2 320 cm－1處出現(xiàn)一小峰；在波數(shù)1 630 cm－1處有較明顯尖峰；在波數(shù)1 500～1 200 cm－1處有一段平緩且不明顯小峰；在波數(shù)1 440～1 317 cm－1處亦然，在1 412 cm－1附近有一吸收峰；指紋區(qū)1 060 cm－1附近有一強(qiáng)而寬的吸收峰；以上吸收峰均反映了玉米種子內(nèi)部成分的光聲光譜特性。

圖4 不同老化時(shí)間玉米種子的光聲光譜Fig. 4 Photoacoustic spectroscopy of maize seeds with different aging time

2.2 PCA特征波長(zhǎng)提取

主成分分析(Principal component analysis,PCA)旨在實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)降維，消除眾多信息相互重疊的部分[13]。本文對(duì)已經(jīng)預(yù)處理過(guò)的每個(gè)深度的樣本進(jìn)行主成分分析，經(jīng)過(guò)預(yù)處理之后，每條玉米種子光聲光譜有727個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，各檢測(cè)深度的玉米種子光譜信息組成數(shù)據(jù)矩陣。雖均可作為模型的輸入，但大量的數(shù)據(jù)會(huì)顯著增加計(jì)算量，同時(shí)信息冗余也會(huì)導(dǎo)致過(guò)擬合而降低模型的預(yù)測(cè)精度，因此利用主成分分析分別獲取各檢測(cè)深度數(shù)據(jù)矩陣的主成分及相應(yīng)貢獻(xiàn)率，以95%為目標(biāo)累積貢獻(xiàn)率選取主成分，完成光聲光譜的特征提取，特征光譜如圖5。

2.3 玉米發(fā)芽率檢測(cè)模型的建立與驗(yàn)證

圖5 ‘京黏1號(hào)’500 Hz (8 μm)特征光譜Fig. 5 Characteristic spectrum of ‘Jingnian No.1’ at 500 Hz (8 μm)

為優(yōu)化玉米光聲光譜發(fā)芽率預(yù)測(cè)模型，分別采用偏最小二乘法回歸(Partial least squares regression, PLSR)、BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(Back propagation neural network, BPNN)、支持向量回歸(Support vector regression, SVR)和廣義回歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(Generalized regression neural network, GRNN) 4種建模方法，在7個(gè)檢測(cè)斬波頻率下建立28種玉米種子發(fā)芽率預(yù)測(cè)模型。各檢測(cè)斬波頻率以3∶1為比例隨機(jī)選出訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集，將特征光譜作為模型輸入，玉米種子發(fā)芽率作為模型輸出，建模結(jié)果對(duì)比見(jiàn)表2和表3。

由表2可見(jiàn)，‘京黏1號(hào)’玉米在不同深度下的SVR建模結(jié)果均較優(yōu)，BP、PLSR和GRNN模型在不同深度下的結(jié)果優(yōu)劣各異，且穩(wěn)定性較差。綜合建模精度和采樣時(shí)間兩方面因素，選定500 Hz為最優(yōu)檢測(cè)頻率，該頻率下訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集的相關(guān)系數(shù)較高，且相對(duì)偏差較小。其余5個(gè)品種玉米的發(fā)芽率預(yù)測(cè)模型建立結(jié)果與‘京黏1號(hào)’趨勢(shì)相同，均在500 Hz調(diào)制頻率下SVR預(yù)測(cè)結(jié)果最優(yōu)。

表2 不同深度‘京黏1號(hào)’光聲光譜建模結(jié)果Table 2 Photoacoustic spectroscopy modeling results of ‘Jingnian No.1’ with different depths

表3 單一品種玉米和混合玉米最優(yōu)建模(SVR模型)結(jié)果Table 3 Optimal modeling (SVR modle) results of single cultivar mazie and mixed-cultivar maize

表3為6個(gè)品種玉米種子以最優(yōu)模型(SVR模型)獨(dú)立、混合建模的結(jié)果。由表3可見(jiàn)，訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集的相關(guān)系數(shù)較高，且相對(duì)偏差較小，表明SVR建模方法對(duì)單一品種玉米種子和多品種混合玉米種子的發(fā)芽率預(yù)測(cè)均適用，且不受玉米表面顏色影響。同時(shí)，混合建模時(shí)，訓(xùn)練集相關(guān)系數(shù)為0.994 5，均方根誤差為0.974 8，預(yù)測(cè)集相關(guān)系數(shù)為0.942 1，均方根誤差為1.387 8，雖然建模效果評(píng)定為優(yōu)良，但精度較單一品種玉米種子建模精度相比略低。單一品種玉米和混合玉米發(fā)芽率的SVR預(yù)測(cè)模型見(jiàn)圖6。

圖6 單一品種玉米和多種混合玉米的SVR建模結(jié)果Fig. 6 SVR modeling results of single cultivar mazie and mixed-cultivar maize

3 討論與結(jié)論

基于不同老化時(shí)間玉米膜結(jié)構(gòu)完整性差異、玉米種子內(nèi)部物質(zhì)發(fā)生變化的生物學(xué)原理及光聲光譜檢測(cè)的物理學(xué)原理對(duì)玉米發(fā)芽率進(jìn)行預(yù)測(cè)。已有生物學(xué)分析[14-15]表明：隨著玉米種子老化劣變，玉米種子發(fā)芽率降低，其內(nèi)部酶基團(tuán)(主要元素：C、H、O、N)的活性也逐漸降低，如玉米內(nèi)部的過(guò)氧化物酶、脫氫酶、過(guò)氧化氫酶等；同時(shí)，可溶性糖(主要元素：C、H、O)和丙二醛 (主要元素：C、H、O)含量逐漸增加，可溶性蛋白 (主要元素：C、H、O、N、S等)含量不斷減少。光聲光譜檢測(cè)技術(shù)能夠通過(guò)對(duì)光轉(zhuǎn)換成聲的能力大小的探測(cè)來(lái)確定物質(zhì)的熱學(xué)性質(zhì)和光譜學(xué)性質(zhì)，改變調(diào)制頻率便可獲取玉米種子不同深度下物質(zhì)變化的信息。

在500 Hz時(shí)，玉米種子的生物學(xué)變化最為敏感，其中：可溶性糖和蛋白質(zhì)等C—O鍵、C—N鍵的伸縮振動(dòng)導(dǎo)致波數(shù)1 160～1 000 cm－1的波段內(nèi)出現(xiàn)吸收峰；油脂和纖維素等C—O鍵和C—C鍵的伸縮振動(dòng)導(dǎo)致波數(shù)1 060 cm－1附近強(qiáng)而寬的吸收峰；波數(shù)1 412 cm－1附近的吸收峰為淀粉中C—O—O、CH2伸縮振動(dòng)吸收區(qū)；波數(shù) 1 440～1 317 cm－1附近的吸收峰為亞甲基和甲基對(duì)稱彎曲振動(dòng)及CH3剪式振動(dòng)吸收；波數(shù)1 500～1 200 cm－1范圍內(nèi)的吸收峰是多糖和蛋白質(zhì)混合振動(dòng)的吸收區(qū)；波數(shù)1 630 cm－1處小的吸收峰主要由蛋白質(zhì)C—O鍵的伸縮振動(dòng)(酰胺I)和水的O—H鍵的彎曲振動(dòng)以及不飽和油脂中C—C鍵的伸縮振動(dòng)疊加而導(dǎo)致；波數(shù)2 320 cm－1處的小吸收峰由光聲池中殘余CO2氣體導(dǎo)致；波數(shù)3 000～2 850 cm－1處的尖狀吸收峰主要為丙二醛和纖維素等物質(zhì)的C—H鍵伸縮振動(dòng)所導(dǎo)致；波數(shù)3 500～3 100 cm－1處寬的吸收峰主要由水中O—H鍵和蛋白質(zhì)中N—H鍵振動(dòng)伸縮的疊加作用導(dǎo)致[16-18]。

本文采用基于深度掃描的單粒玉米發(fā)芽率光聲光譜檢測(cè)方法，采集3種顏色、6個(gè)品種的不同老化程度的玉米種子在不同調(diào)制頻率下的光聲光譜信息，通過(guò)EEMD和PCA對(duì)原始光聲光譜進(jìn)行去噪和降維處理，分別結(jié)合PLSR、BPNN、GRNN和SVR進(jìn)行建模。結(jié)果表明，500 Hz為最佳掃描頻率，SVR建模為最優(yōu)發(fā)芽率預(yù)測(cè)模型；單一品種玉米種子發(fā)芽率預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)均超過(guò)0.980 0，混合品種玉米種子發(fā)芽率預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)達(dá)0.942 1。結(jié)果表明，光聲光譜深度掃描技術(shù)通過(guò)拓展光譜、聲音和深度信息預(yù)測(cè)玉米種子發(fā)芽率是可行的，可為多維、高精度檢測(cè)種子發(fā)芽率提供新方法。