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    基于NGF-TrkA通路研究電針療法治療糞失禁兔動(dòng)物模型的作用機(jī)制*

    2020-11-28 07:24:58王曉鋒崔國(guó)策李宇飛何穎華智建文周嬌嬌李嘉俊李華山
    針灸臨床雜志 2020年10期
    關(guān)鍵詞:電針療法生物科技靜息

    王曉鋒,崔國(guó)策,李宇飛,何穎華,智建文,周嬌嬌,李嘉俊,李華山

    (中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院,北京 100053)

    大便失禁即肛門失禁,為排便功能紊亂的一種癥狀,雖不直接威脅生命,但嚴(yán)重干擾患者正常工作和生活,給患者造成生理和心理上的痛苦[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示肛門失禁發(fā)生率在1.4%~18%,而在養(yǎng)老院人群中可達(dá)50%[2]。隨著我國(guó)人口老齡化加劇,肛門失禁發(fā)生率呈上升趨勢(shì),對(duì)人類健康造成極大威脅。電針療法是針灸與電刺激兩者結(jié)合的綜合方法,具有針對(duì)性強(qiáng)、適應(yīng)證廣、安全性高和醫(yī)療成本低的特點(diǎn),社會(huì)反應(yīng)普遍較好[3]。既往研究報(bào)道電針療法對(duì)大便失禁有一定改善作用[4]。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Nerve growth factor,NGF)是一種神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子,具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化、生長(zhǎng)的作用[5]。酪氨酸激酶受體A(Tyrosine kinase receptor A,TrkA)是NGF的特異性高親和力受體,介導(dǎo)NGF大多數(shù)生物功能[6]。有研究顯示NGF-TrkA信號(hào)通路在神經(jīng)系統(tǒng)病變發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[7]。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)大便失禁的基礎(chǔ)研究較少,電針療法對(duì)大便失禁的具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究基于NGF-TrkA通路研究電針療法治療糞失禁兔動(dòng)物模型的作用機(jī)制,以期為臨床治療策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和進(jìn)一步研究線索,現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

    新西蘭兔30只,SPF級(jí),雄性,8月齡,購(gòu)于深圳康泰生物制品股份有限公司[生產(chǎn)許可SYXK(粵)2018-0193]。將30只新西蘭兔適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和治療組,每組10只。

    1.2 糞失禁兔動(dòng)物模型制備

    取模型組和治療組新西蘭兔,按30 mL/kg耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(湖北鴻運(yùn)隆生物科技有限公司)予以麻醉,麻醉成功后固定實(shí)驗(yàn)兔,骶尾部剃毛,常規(guī)消毒,取Kimberly-Clark專用穿刺針(上海愛澤工業(yè)設(shè)備有限公司)于第4薦神經(jīng)的解剖部位穿刺,穿刺到位后將穿刺針針芯更換射頻針針芯,選擇射頻治療儀(加拿大Baylis公司,型號(hào):PMG-230)按鍵中的CURRENT鍵,增大電流直至實(shí)驗(yàn)兔肛門出現(xiàn)抽搐、收縮,觀察電流值0.6~1.0 mA時(shí)開啟熱凝射頻治療模式(時(shí)間設(shè)定:90 s,溫度設(shè)定:85℃),開始射頻能量傳輸,操作完成后,待射頻針溫度<40℃時(shí)再次傳輸射頻能量。術(shù)后14 d時(shí)測(cè)定肛門靜息壓<15 mmHg即為造模成功。

    1.3 干預(yù)方法

    造模成功后,對(duì)照組和模型組不作任何干預(yù),治療組采用電針治療。電針治療步驟:針刺雙側(cè)中髎(骶部髂后上棘內(nèi)下方,第3骶后孔處,直刺15 mm)、單側(cè)三陰交(后肢內(nèi)踝尖直上方3 cm處,直刺2 mm)、單側(cè)足三里(后肢膝關(guān)節(jié)前處稍下方,腓骨小頭下2.5 cm,直刺10 mm),針刺后連接電針治療儀(廣州市美強(qiáng)醫(yī)療科技有限公司,型號(hào):XS-998B),雙側(cè)中髎一組,三陰交與足三里一組。刺激參數(shù):持續(xù)波,頻率10 Hz,脈寬200 μs,取穴為同一側(cè)。隔日治療1次,每次20 min,連續(xù)治療3個(gè)月。

    1.4 評(píng)價(jià)指標(biāo)

    1.4.1 肛門靜息壓 于治療結(jié)束測(cè)定各組新西蘭兔肛門靜息壓,操作如下:固定各組新西蘭兔,打開消化道動(dòng)力測(cè)定儀(廣州市瑞橋貿(mào)易有限公司,型號(hào):XDJ-S8G),初始化完成后測(cè)壓管道注水、調(diào)零,實(shí)驗(yàn)兔肛門內(nèi)插入測(cè)壓管3 cm,按下“取值鍵”讀取數(shù)值,緩慢退出測(cè)壓管,每隔1 cm讀取數(shù)值,共讀取3次,取平均值。

    1.4.2 肛門括約肌組織形態(tài)學(xué)變化 各組新西蘭兔肛門靜息壓測(cè)定完成后,處死5只,取其肛門括約肌組織,用10%甲醛溶液(上海鈺博生物科技有限公司)固定,梯度酒精(北京宏昌信科技有限公司)脫水,二甲苯(上海麥克林生化科技有限公司)透明,石蠟包埋成塊,采用組織切片機(jī)(上海精密儀器儀表有限公司,型號(hào):McIlwain)切成5 μm連續(xù)切片,脫蠟水化,采用HE染色試劑盒(上海威奧生物科技有限公司)染色,流水沖洗,烘片0.5 h,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠固封劑(天津百倫斯生物技術(shù)有限公司)封片,采用光學(xué)顯微鏡(北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司,型號(hào):SH11/YF-9)觀察HE染色結(jié)果。

    1.4.3 肛門括約肌組織中NGF、TrkA蛋白表達(dá)量 HE染色完成后,處死剩余5只新西蘭兔,取其肛門括約肌組織,剪碎,加RIPA裂解液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司),置于組織勻漿器(北京海德創(chuàng)業(yè)生物科技有限公司)中,10 000 rpm離心5 min,取上清,使用BCA試劑盒(上海炎熙生物科技有限公司)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取總蛋白上樣,電泳,切膠,轉(zhuǎn)至PVDF膜上,選擇濕轉(zhuǎn),TBS-T 25℃封閉1 h,加入NGF一抗(1∶500)(上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司)、TrkA一抗(1∶300)(湖南遠(yuǎn)泰生物技術(shù)有限公司)、GAPDH一抗(1∶400)(深圳欣博盛生物科技有限公司),4℃搖床過夜,PBST洗膜,加二抗(1∶2 000)(武漢愛博泰克生物科技有限公司),4℃搖床過夜,PBST洗膜,ECL發(fā)光試劑盒(上海碩嘉生物科技有限公司)顯色、顯影,以GAPDH為內(nèi)參蛋白,用Image Quant TL軟件分析各條帶的灰度值。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 各組新西蘭兔肛門靜息壓比較

    模型組新西蘭兔肛門靜息壓顯著低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);治療組新西蘭兔肛門靜息壓顯著高于模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);治療組新西蘭兔肛門靜息壓顯著低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

    表1 各組新西蘭兔肛門靜息壓比較

    2.2 各組新西蘭兔肛門括約肌組織形態(tài)學(xué)變化

    對(duì)照組新西蘭兔肛門括約肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,肌纖維連續(xù)完整,括約肌厚度、固有層厚度、肌纖維數(shù)量均正常;模型組新西蘭兔肛門括約肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)異常,括約肌全層變薄,固有層結(jié)締組織變厚,肌纖維數(shù)量明顯減少、變細(xì)、斷裂,橫紋肌致密程度明顯下降;治療組新西蘭兔肛門括約肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)較模型組明顯改善,括約肌全層變厚,固有層結(jié)締組織變薄,肌纖維變粗并趨于完整,肌纖維數(shù)量增多,橫紋肌致密程度增加。見圖1。

    注:A為對(duì)照組,B為模型組,C為治療組。圖1 各組新西蘭兔肛門括約肌組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色,100×)

    2.3 各組新西蘭兔肛門括約肌組織中NGF、TrkA蛋白表達(dá)量比較

    模型組新西蘭兔肛門括約肌組織中NGF、TrkA蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);治療組新西蘭兔肛門括約肌組織中NGF、TrkA蛋白表達(dá)量顯著高于模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);治療組新西蘭兔肛門括約肌組織中NGF、TrkA蛋白表達(dá)量顯著高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖2。

    表2 各組新西蘭兔肛門括約肌組織中NGF、TrkA蛋白表達(dá)量比較

    圖2 各組新西蘭兔肛門括約肌組織中NGF、TrkA蛋白表達(dá)量

    3 討論

    大便失禁是指肛門括約肌對(duì)氣體及糞便控制能力減弱或消失,糞便不自主地排泄,至少持續(xù)3個(gè)月。長(zhǎng)期大便失禁會(huì)使肛周皮膚受溢出糞便反復(fù)刺激,使皮膚處于潮濕和代謝產(chǎn)物侵蝕狀態(tài),造成壓力性潰瘍、會(huì)陰部皮炎和骶尾部皮炎等,嚴(yán)重影響患者健康水平與生活質(zhì)量。大便失禁常見病因包括肛門直腸畸形、解剖結(jié)構(gòu)損傷(結(jié)腸肛管吻合術(shù)、低位前切除術(shù)等)、神經(jīng)系統(tǒng)病變(腦梗死、脊髓結(jié)核和運(yùn)動(dòng)性共濟(jì)失調(diào)等)、直腸平滑肌病變和糞便成分異常(腸易激綜合征、感染性腹瀉)等[8]。目前大便失禁治療方法繁多,治療效果尚不確切,作用機(jī)制仍不清楚,因此有必要開展基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究,為大便失禁發(fā)生機(jī)理和臨床治療奠定基礎(chǔ)。

    電刺激療法是采用低頻脈沖電刺激脊髓神經(jīng),使患者恢復(fù)身體機(jī)能,有效提高生活質(zhì)量。近年來電刺激療法已廣泛應(yīng)用于癱瘓、脊柱側(cè)凸和胃食管反流病(Gastroesophageal reflux disease,GERD)等疾病[9-11]。針灸是我國(guó)特有的治療疾病的手段,為中醫(yī)學(xué)的一個(gè)重要組成部分,主要通過經(jīng)絡(luò)、腧穴的傳導(dǎo)作用達(dá)到治療全身疾病目的,其作為補(bǔ)充和替代療法在西方國(guó)家也吸引了越來越多的關(guān)注[12]。電針療法是針灸與電刺激兩者結(jié)合的綜合方法,具有針對(duì)性強(qiáng)、適應(yīng)證廣、安全性高和醫(yī)療成本低的特點(diǎn)。有研究證實(shí)電針療法具有興奮性和抑制性的雙向調(diào)節(jié)作用,可通過促進(jìn)肛門括約肌收縮改善機(jī)體排便功能[13]。中醫(yī)臨床實(shí)踐證實(shí)電針療法對(duì)脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)后神經(jīng)源性膀胱有確切療效[14]。本研究選擇主治大小便不利的中髎、三陰交、足三里3個(gè)穴位進(jìn)行電針治療,發(fā)現(xiàn)模型組新西蘭兔肛門靜息壓顯著低于對(duì)照組,治療組新西蘭兔肛門靜息壓顯著高于模型組,這與既往研究報(bào)道一致,提示電針療法對(duì)大便失禁有一定改善作用[4]。本研究HE染色顯示治療組新西蘭兔肛門括約肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)較模型組明顯改善,括約肌全層變厚,固有層結(jié)締組織變薄,肌纖維變粗并趨于完整,肌纖維數(shù)量增多,橫紋肌致密程度增加,由此提示電針療法可有效改善大便失禁實(shí)驗(yàn)兔肛門括約肌組織病理改變。NGF是一種神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子,具有神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)和促突起生長(zhǎng)雙重生物學(xué)功能,并在中樞及周圍神經(jīng)元發(fā)育、分化、生長(zhǎng)和再生過程中有重要的調(diào)控作用。此外NGF還能調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能,抑制腫瘤有絲分裂,促進(jìn)創(chuàng)口組織修復(fù)反應(yīng)。酪氨酸激酶受體(Tyrosine kinase receptor,Trk)由細(xì)胞外、跨膜及細(xì)胞內(nèi)三部分組成,具有酪氨酸蛋白激酶活性,其可使位于膜內(nèi)區(qū)段上的酪氨酸蛋白激酶(Tyrosine protein kinase,TPK)激活,使自身肽鏈和膜內(nèi)蛋白底物中的酪氨酸殘基(Tyrosine residue,PTYR)磷酸化,從而將細(xì)胞內(nèi)信息傳遞到細(xì)胞外,導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄過程改變及細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。TrkA是NGF的特異性高親和力受體,能夠介導(dǎo)NGF一系列生物學(xué)效應(yīng)[15]。相關(guān)研究表明NGF-Trk A信號(hào)通路與腫瘤增殖、血管生成和神經(jīng)系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)[16]。既往研究顯示電針可以促進(jìn)腦缺血損傷大鼠海馬組織中TrkA表達(dá),從而減少腦缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡[17]。本研究顯示模型組新西蘭兔肛門括約肌組織中NGF、TrkA蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組,治療組新西蘭兔肛門括約肌組織中NGF、TrkA蛋白表達(dá)量顯著高于模型組,電針療法可能通過激活NGF-TrkA信號(hào)通路對(duì)糞失禁兔動(dòng)物模型起到改善作用,這可為臨床大便失禁的治療提供新的思路。

    綜上所述,電針療法可能通過激活NGF-TrkA信號(hào)通路對(duì)糞失禁兔動(dòng)物模型起到改善作用,這可為臨床治療大便失禁提供理論依據(jù)。但本研究時(shí)間較短,仍有待進(jìn)一步研究。

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