26種中草藥提取物對雞源多殺性巴氏桿菌的體外抑菌試驗

王方雨，李 寧，孫雪峰，曹 帥，趙雅麗

(1.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點實驗室，河南 鄭州450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州450002）

雞巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌引起的傳染病，是我國禽類養(yǎng)殖業(yè)中重要的傳染病之一，多殺性巴氏桿菌也是人獸共患傳染病病原菌[1,2]。該病一般發(fā)生在季節(jié)交替的時節(jié)，雞巴氏桿菌病可引起雞體溫升高，精神萎靡，引起敗血癥，發(fā)病1～3 天內(nèi)即可出現(xiàn)死亡，但整體致死率低，一般為為1%～10%。多殺性巴氏桿菌分為5 個血清型，廣泛分布，發(fā)病情況與雞的抗病能力和多殺性巴氏桿菌的毒力有關(guān)[3]。

巴氏桿菌病的治療以抗生素為主，但隨著抗生素的廣泛甚至過度使用，出現(xiàn)了抗生素藥效下降的現(xiàn)象，病原菌逐漸對抗生素產(chǎn)生耐藥性?？股貧埩粼趧游矬w內(nèi)，并部分排出環(huán)境中，對人類的食品安全和健康安全產(chǎn)生了威脅。隨著人們對抗生素認(rèn)識的提高，形成了減少抗生素使用的共識，在此背景下，研究者加大了對中藥治療細(xì)菌性疾病的研究。中草藥具有不易產(chǎn)生耐藥性、殘留低、價格便宜等優(yōu)點[4]，中草藥用于畜禽疾病治療的研究和實踐越來越多。本試驗研究了26種中草藥體外對雞源多殺性巴氏桿菌的最小抑菌濃度、最低殺菌濃度和敏感性等，期望篩選出對多殺性巴氏桿菌抑菌/殺菌強(qiáng)、耐藥性低的中草藥，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物

連翹、蒲公英、板藍(lán)根、金銀花、黃芩、黃連、黃柏、黨參、白術(shù)、黃芪、赤石脂、柴胡、石榴皮、穿心蓮、菊花、防風(fēng)、地錦草、馬齒莧、仙鶴草、白頭翁、吳茱萸、龍膽草、大黃、魚腥草、獨活、地丁，購自河南省禹州市中藥材批發(fā)行，所有藥物經(jīng)檢定均符合生藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 菌種

多殺性巴氏桿菌（雞源，CVCC1674），由中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心提供。

1.1.3 主要試劑

氯化鈉為分析純，蛋白胨、牛肉浸膏和瓊脂等均為生化試劑。麥?zhǔn)媳葷峁埽◤V東環(huán)凱微生物科技有限公司）。

1.1.4 主要儀器

恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、振蕩培養(yǎng)箱、電爐、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、移液槍、中藥粉碎機(jī)、高壓滅菌鍋、生物安全柜。

1.1.5 培養(yǎng)基

（1）普通肉湯培養(yǎng)基：牛肉浸膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，加純化水至1000 ml，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌15 min。

（2）普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：牛肉浸膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，加純化水至1000 ml，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 26種中草藥提取物的制備

精密稱取每味中藥各100 g，加8 倍量蒸餾水煎煮，沸騰后改用文火煎1 h，期間始終保持8倍量水，用4 層紗布過濾，殘渣加6 倍量水同法煎煮1 h 后過濾，合并兩次濾液，減壓濃縮至100 ml，使其濃度為1 g/ml。

1.2.2 多殺性巴氏桿菌菌液的制備

挑取普通營養(yǎng)瓊脂平板上形態(tài)相同的菌落至少4～5 個，接種至5 ml 普通肉湯培養(yǎng)基中。37 ℃培養(yǎng)至菌液濃度達(dá)到或超過0.5 麥?zhǔn)媳葷峁軡舛?，菌液濃度約為1～2×108 CFU/ml。用空白普通肉湯培養(yǎng)基校正菌液濃度，調(diào)至與0.5 麥?zhǔn)媳葷峁芟嗤?，?.5 麥?zhǔn)隙鄽⑿园褪蠗U菌菌液。

1.2.3 最小抑菌濃度（MIC）的測定

采用試管二倍稀釋法測定藥液對供試菌的MIC。（1）取無菌試管11 支，每管加入普通肉湯培養(yǎng)基2.0 ml；第1 管中加入受試藥液2.0 ml，混勻后吸取2.0 ml 至第2 管中，依次作2 倍梯度稀釋，直至第9 管取出2.0 ml 棄去；第10 管不加藥液，作為陽性對照；第11 管加受試藥液2.0 ml，混勻后取出2.0 ml 棄去，不加菌液，作為陰性對照，各管平行3 份。（2）用普通肉湯培養(yǎng)基將0.5 麥?zhǔn)隙鄽⑿园褪蠗U菌菌液稀釋100 倍制成細(xì)菌稀釋液，取細(xì)菌稀釋液0.1 ml 分別加入上述1～10 管中混勻，11 號管加0.1 ml 滅菌生理鹽水，各管置37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果。

1.2.4 最小殺菌濃度（MBC）的測定

取MIC 終點濃度以上未生長細(xì)菌的各稀釋管內(nèi)培養(yǎng)物0.1 ml，接種于瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察有無細(xì)菌生長，培養(yǎng)基中無細(xì)菌生長的最低濃度即為受試藥液的最低殺菌濃度。

1.2.5 藥物敏感試驗

采用管碟法對藥物的敏感性進(jìn)行試驗。將普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，放置凝固，用作底層培養(yǎng)基。吸取菌液0.1 ml 接種至底層培養(yǎng)基上，用涂棒將菌液涂勻，在平皿底部作好相應(yīng)標(biāo)記，用無菌鑷子在每個平皿中等距離放置3 個牛津杯，用滴管分別將1g/ml 藥液加到牛津杯中，以滴滿為度，蓋上平皿蓋。然后將滴加藥液的平皿水平置恒溫箱內(nèi)，37℃培養(yǎng)18～24 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。

判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌直徑＜8 mm，為不敏感（耐藥）；抑菌直徑8～13 mm 之間，為低度敏感；抑菌直徑在13～19 mm 之間，為中度敏感；抑菌直徑＞19 mm，為高度敏感。

2 結(jié)果與分析

2.1 26 種中藥提取物對多殺性巴氏桿菌的MIC和MBC 值

表1-1 體外最低抑菌濃度和最低殺菌濃度試驗結(jié)果

由表1-1 可以看出，除黨參外，其它25 種中草藥提取物均對多殺性巴氏桿菌有一定的抑菌效果或殺菌效果。其中黃連的抑菌效果最好，MIC值為15.6 mg/ml，地丁的殺菌效果最好，MBC 值為31.3 mg/ml；在體外抑菌方面，抑菌效果較好的中草藥分別為黃連、地丁、黃芪、石榴皮和連翹，殺菌效果較好的中草藥分別為地丁和黃連，MBC 分別為31.3 mg/ml 和62.5 mg/ml。黨參的體外抑菌和殺菌效果均較差，MIC 和MBC 值均超過了500 mg/ml。赤石脂和吳茱萸的抑菌和殺菌效果均較差，MIC 和MBC 值＞500 mg/ml。地錦草的殺菌效果較差，MBC 值＞500 mg/ml。

2.2 管碟法測定26 種中藥提取物對多殺性巴氏桿菌的藥敏試驗結(jié)果

表1-2 藥敏試驗結(jié)果

從表1-2 可以看出，多殺性巴氏桿菌對各中草藥提取物的敏感性不同，其中對黃連的敏感性最強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)26.17mm；多殺性巴氏桿菌對地丁、石榴皮、連翹等中草藥提取物高度敏感，抑菌圈直徑分別達(dá)到了23.22 mm、20.37 mm、19.53mm。多殺性巴氏桿菌對黨參、赤石脂、吳茱萸、地錦草、獨活等中草藥提取物有耐藥性。

3 結(jié)論與討論

3.1 各中藥體外抑菌試驗方法的選擇

關(guān)于中藥體外抑菌活性的測定方法很多，一般采用的方法有固體培養(yǎng)基法、紙片抑菌法、平皿稀釋法、平板打孔擴(kuò)散法等，本試驗采用試管二倍稀釋法和管碟法相結(jié)合對各中藥抑菌活性進(jìn)行研究，在試管二倍稀釋法試驗過程中由于需要將中藥提取液調(diào)制成弱堿性，加入了一定量的堿液，考慮到這有可能對試驗結(jié)果造成影響，選用管碟法同時進(jìn)行，方便對兩種測定方法的結(jié)果進(jìn)行對比，本研究結(jié)果顯示，這兩種方法具有緊密的相關(guān)性。

3.2 中藥對多殺性巴氏桿菌的抑菌效果存在差異

本研究選用連翹、蒲公英、黃連、白頭翁等26種中藥對多殺性巴氏桿菌進(jìn)行體外抑菌試驗，結(jié)果表明各中藥對多殺性巴氏桿菌均有一定的抑制作用，但不同中藥的抑菌效果不同。其中黃連、地丁、石榴皮、連翹等具有很強(qiáng)的抑菌作用，而黨參、赤石脂、吳茱萸、地錦草等對雞源多殺性巴氏桿菌的抑菌/殺菌效果較差，多殺性巴氏桿菌對其不敏感或產(chǎn)生耐藥性。本試驗研究結(jié)果與相關(guān)報道不盡相同[5,6]，可能跟中藥來源、產(chǎn)地、提取方式、病原菌血清型等有關(guān)。

曲徑等[7]研究顯示黃連、黃柏、地榆和艾葉為相加、協(xié)同作用。李達(dá)怡等[1]研究顯示黃連與四制艾葉聯(lián)合具有協(xié)同作用，優(yōu)于兩種單藥各自的抑菌活性。以上研究表明多種中草藥聯(lián)合抑菌的效果優(yōu)于單味中藥的抑菌效果，為本試驗以后的研究提供了新的思路。