一種氯化鐵誘導(dǎo)血栓生成的小鼠大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端缺血模型

陳青芳，趙順英，董雯，龔婷，陳文濤，劉向榮

中國面臨著世界上最大的卒中挑戰(zhàn)，卒中在2018年導(dǎo)致157萬人死亡，是中國排名第三的死亡原因，其中70%為缺血性卒中[1-3]。腦或頸部動(dòng)脈粥樣硬化性原位血栓形成、心源性栓子阻塞腦血管、血管狹窄均可導(dǎo)致急性腦血管阻塞，是引起急性缺血性卒中的常見病因[3]。臨床上大腦中動(dòng)脈是缺血性卒中高發(fā)栓塞的血管。目前常用線栓堵塞小動(dòng)物大腦中動(dòng)脈制作栓塞模型，并根據(jù)是否將阻塞栓線拔出分為永久性缺血和再灌注兩種模型[4]。也可用不同方法將大腦中動(dòng)脈的遠(yuǎn)端血流阻斷，制作永久性大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端缺血模型[5-6]。但以上模型偏重的是血流堵塞狀態(tài)，并無血栓形成，與疾病的實(shí)際狀態(tài)有一定差距。

本研究利用氯化鐵（ferric chloride，F(xiàn)eCl3）溶液的強(qiáng)氧化劑特性，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，進(jìn)而引起血管內(nèi)血小板聚集形成血栓，使得小鼠大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端栓塞（distal middle cerebral artery occlusion，dMCAO），充分模擬實(shí)際腦缺血的發(fā)病進(jìn)程和狀態(tài)。小鼠dMCAO模型穩(wěn)定且死亡率較MCAO模型低，為后續(xù)血栓形成和藥物溶栓研究提供支撐。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥物 雄性C57BL/6J小鼠，24只，體重24.0±0.5 g（北京華阜康生物科技股份有限公司），適應(yīng)性飼養(yǎng)在22～26 ℃、濕度50%～60%的環(huán)境中，自由獲取食水。本實(shí)驗(yàn)實(shí)施遵照動(dòng)物倫理要求。FeCl3（天津福晨化學(xué)試劑廠，中國）以生理鹽水配制成質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為10%的澄清溶液。

1.2 模型制作 小鼠隨機(jī)分為兩組：假手術(shù)組和腦缺血（dMCAO）組，每組12只小鼠。稱重后異氟烷吸入麻醉，左側(cè)俯臥位暴露右側(cè)顳肌，顱骨鉆孔。暴露右側(cè)大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端，用浸潤10% FeCl3溶液的0.5 mm×0.5 mm濾紙貼于大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端動(dòng)脈分叉處3 min，除去濾紙，用生理鹽水清洗表面鹽溶液，覆蓋可吸收性明膠海綿，縫合。手術(shù)期間保持小鼠肛溫36～38 ℃。假手術(shù)組用生理鹽水替代FeCl3溶液進(jìn)行處理。

1.3 腦表面及顳側(cè)血流量觀測 以FeCl3開始刺激的時(shí)間為0時(shí)刻，用多普勒散斑掃描儀記錄全腦表面血流量及大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端的動(dòng)脈血流量，每組6只小鼠。記錄手術(shù)前的基礎(chǔ)值、術(shù)后10 min、術(shù)后1 d和術(shù)后7 d的腦血流量以及顳側(cè)大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端動(dòng)脈血流量的變化情況。每只小鼠作自身前后對(duì)照，腦血流量百分比=（該時(shí)間血流量/基礎(chǔ)值血流量）×100%。

1.4 神經(jīng)功能與運(yùn)動(dòng)感覺評(píng)價(jià) 造模后1 d、3 d、5 d、7 d對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)學(xué)功能評(píng)價(jià)和膠黏紙測試，每組6只小鼠，采用3種神經(jīng)功能評(píng)分以全面評(píng)價(jià)小鼠在模型中的神經(jīng)功能損傷情況，降低人為因素影響，包括：改良加西亞評(píng)分（modified Garcia score，mGS）[7]、改良神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度評(píng)分（modified neurological severity score，mNSS）[8]和15分神經(jīng)學(xué)評(píng)估表（15-point neurological evaluation scale，NES）[9]。具體評(píng)分細(xì)則見表1。

膠黏紙測試方法：將0.5 cm×1 cm的紙片黏在小鼠左側(cè)前肢上，正常感知的小鼠會(huì)嘗試將紙片撕去。實(shí)驗(yàn)中記錄小鼠第一次碰觸紙片及完全撕去紙片的時(shí)間，以評(píng)價(jià)其神經(jīng)功能。每只小鼠術(shù)前訓(xùn)練3 d，測試日及訓(xùn)練日每天測試3次，每次間隔時(shí)間為15 min，避免小鼠疲勞或情緒抵抗。

表1 神經(jīng)功能評(píng)分細(xì)則

1.5 腦組織梗死率測定 每組各取6只小鼠在造模后1 d取腦組織，在腦模具中切成1 mm厚的薄片，用2%的TTC溶液在37 ℃浸染15 min，TTC可使活細(xì)胞呈紅色，梗死區(qū)細(xì)胞呈白色，以此標(biāo)記腦組織梗死區(qū)域。用ImageJ軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，梗死率=（左側(cè)大腦正常組織體積-梗死側(cè)正常組織體積）/左側(cè)大腦正常組織體積。

1.6 免疫組織熒光染色 術(shù)后7 d取每組4只小鼠全腦制作冰凍切片，從前至后切成20 μm厚的切片。使用標(biāo)記神經(jīng)元的神經(jīng)元核抗體（NeuN抗體，Millipore，美國）染色以確定腦組織損傷情況，用Vectra Polaris全自動(dòng)定量病理成像系統(tǒng)（Perkin-Elmer，美國）采集圖像數(shù)據(jù)。用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)每只鼠6個(gè)層面的腦組織損傷，腦組織損傷率=各層（左半腦正常組織面積-梗死側(cè)半腦正常組織面積）之和/各層左半腦正常組織面積之和。采用離子化鈣結(jié)合適配分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1）（和光純藥，日本）和CD16/32（BD Pharmingen，美國）及Iba1和CD206（R&D Systems，美國）免疫熒光共染，標(biāo)記缺血區(qū)皮層M1、M2型小膠質(zhì)細(xì)胞，評(píng)價(jià)術(shù)后腦組織缺血區(qū)域附近膠質(zhì)細(xì)胞激活情況，用LSM710激光共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss AG，德國）采集圖像。實(shí)驗(yàn)流程如圖1。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)手術(shù)視野及操作 實(shí)驗(yàn)手術(shù)前暴露顳側(cè)顱骨、暴露大腦中動(dòng)脈血管遠(yuǎn)端的操作視野（圖2A、圖2B）。大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端暴露后可用多普勒散斑血流量儀檢測到清晰的動(dòng)脈血流（圖2C）。用浸潤FeCl3溶液的濾紙?zhí)幚韯?dòng)脈后，血流量顯著下降（圖2D、圖2E）。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖

圖2 手術(shù)視野圖

圖3 不同時(shí)間小鼠術(shù)側(cè)顳側(cè)動(dòng)脈及腦表面血流量變化圖

2.2 術(shù)后不同時(shí)間腦血流量的變化 分別記錄FeCl3溶液處理前、處理后10 min、術(shù)后1 d和7 d的顳側(cè)血流量和腦表面血流量（圖3）。結(jié)果顯示FeCl3溶液處理可使大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端動(dòng)脈血流量下降，并引起腦表面大腦中動(dòng)脈支配區(qū)域血流量減少。dMCAO組術(shù)后10 min顳側(cè)大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端血流量平均下降至初始血流量的33.67%±6.66%（vs假手術(shù)組94.91%±1.46%，P<0.001），術(shù)后1 d和7 d維持在30%以下且持續(xù)下降（dMCAO組vs假手術(shù)組，1 d：29.78%±4.71%vs84.37%±2.93%；7 d：23.68%±3.22%vs77.37%±1.17%，均P<0.001）。dMCAO組大腦中動(dòng)脈支配區(qū)域的腦表面血流量在術(shù)后10 min及術(shù)后1 d為初始值的37.80%±5.86%及38.32%±6.04%（vs假手術(shù)組81.58%±5.24%及81.88%±5.25%，均P<0.001），術(shù)后7 d可能由于側(cè)支循環(huán)的代償，腦表面血流量有所恢復(fù)，但仍與假手術(shù)組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（dMCAO組vs假手術(shù)組：73.71%±5.92%vs93.27%±1.56%，P=0.0156）。

2.3 術(shù)后腦組織梗死率及腦組織損傷 與假手術(shù)組相比，dMCAO組術(shù)后1 d出現(xiàn)明顯的腦組織梗死，主要集中于右側(cè)腦皮層區(qū)域。統(tǒng)計(jì)顯示，dMCAO組平均梗死體積為16.84%±2.15%，與假手術(shù)組（無梗死）相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）（圖4）。

術(shù)后7 d，dMCAO組腦組織損傷的面積百分比為9.81%±2.56%，顯著高于假手術(shù)組（無損傷），P=0.0086，表明該模型術(shù)后7 d小鼠神經(jīng)元受損、腦組織損傷（圖5）。

2.4 神經(jīng)學(xué)評(píng)分及膠黏紙測試 術(shù)前各項(xiàng)神經(jīng)學(xué)評(píng)分和膠黏紙測試，dMCAO組與假手術(shù)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后1 d、3 d、5 d、7 d，dMCAO組與假手術(shù)組相比，3種神經(jīng)學(xué)評(píng)分差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與假手術(shù)組相比，dMCAO組在術(shù)后1 d、3 d、5 d的膠黏紙測試中，撕去膠黏紙的時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

2.5 腦組織膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá) 取小鼠腦組織切片標(biāo)記CD16/32或CD206，與Iba1共染。Iba1和CD16/32標(biāo)記缺血區(qū)皮層M1型小膠質(zhì)細(xì)胞，Iba1和CD206標(biāo)記M2型小膠質(zhì)細(xì)胞。與假手術(shù)組相比，dMCAO組術(shù)后7 d梗死皮層附近M1型和M2型膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)增加，出現(xiàn)大量M2型膠質(zhì)細(xì)胞（圖6），表明該模型術(shù)后腦組織梗死區(qū)附近膠質(zhì)細(xì)胞大量激活，可能與活躍的炎癥反應(yīng)相關(guān)。

圖4 術(shù)后1 d小鼠腦組織梗死率

3 討論

急性缺血性卒中是全球死亡率高、致殘率高的重大疾病[10]，目前研究其病理機(jī)制的動(dòng)物模型主要有大腦中動(dòng)脈線栓模型、大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端凝斷模型、光化學(xué)血栓模型和自身原位血栓模型。大腦中動(dòng)脈線栓模型是經(jīng)典的栓塞模型，可以很好地阻塞大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端，與臨床血管閉塞部位近似度高，是經(jīng)典的急性腦缺血模型[4]。大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端凝斷模型[6]和本研究中的腦缺血模型均針對(duì)該血管的遠(yuǎn)端造模，相對(duì)經(jīng)典線栓模型而言，遠(yuǎn)端造模的動(dòng)物死亡率低，為模型成模后的長期存活提供了可能，可針對(duì)長期的生理病理變化、認(rèn)知恢復(fù)和藥物藥理機(jī)制展開研究[11]。不過，大腦中動(dòng)脈線栓模型和大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端凝斷模型均沒有原位血栓形成，僅物理性地阻斷了血流，雖然有利于研究遠(yuǎn)端組織的缺血缺氧機(jī)制，但無法滿足藥物溶栓、取栓或溶栓后血流變化等的相關(guān)研究。

光化學(xué)誘導(dǎo)血栓形成的血栓模型往往損傷的是以光照為中心的某個(gè)范圍，而且血管損傷和血栓最先出現(xiàn)在毛細(xì)血管、細(xì)靜脈和細(xì)動(dòng)脈，其次才影響到大靜脈，最后受影響的才是大動(dòng)脈，與臨床上的動(dòng)脈血栓堵塞過程有較大差異[12-13]。自身原位血栓模型需要先用動(dòng)物自體血制作符合目的血管直徑的血栓，再將血栓送到大腦中動(dòng)脈或者大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端，理論上能較好模擬腦缺血過程及狀態(tài)，但操作技術(shù)難度較大，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求高[14-15]。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用氯化鐵誘導(dǎo)血栓的方法建立腦缺血模型，一方面滿足了腦缺血的目的，另一方面形成大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端的血管內(nèi)原位血栓，彌補(bǔ)了目前線栓模型和凝斷模型的沒有血栓、僅機(jī)械阻斷的不足，也突破了光化學(xué)血栓模型范圍性損傷的局限。且本實(shí)驗(yàn)手術(shù)操作簡單便捷，所需設(shè)備常見，易形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)流程。

圖5 術(shù)后7 d小鼠腦組織損傷

表2 神經(jīng)功能評(píng)分及膠黏紙測試結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)中，我們使用FeCl3溶液刺激大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端血管形成穩(wěn)定血栓，建立了較好的小鼠長期腦缺血模型。手術(shù)操作簡便，在刺激后10 min造成顳側(cè)大腦中動(dòng)脈血流量和腦表面血流量下降并維持至術(shù)后7 d，術(shù)后1 d腦組織皮層有明顯梗死，且術(shù)后7 d仍有腦組織損傷。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步用mGS、mNSS和NES 3種神經(jīng)學(xué)評(píng)分方法評(píng)價(jià)小鼠感覺和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能損傷，發(fā)現(xiàn)該血栓造成的腦缺血模型在術(shù)后1～7 d均有明顯的運(yùn)動(dòng)障礙和感覺或反射損傷，另外，該模型術(shù)后膠黏紙測試結(jié)果也與假手術(shù)組有差異。表明該模型可以形成小鼠腦功能損傷，包括運(yùn)動(dòng)和感覺功能的受損。另外，該模型在術(shù)后7 d可觀察到梗死區(qū)域附近膠質(zhì)細(xì)胞的激活現(xiàn)象，M1、M2型膠質(zhì)細(xì)胞大量出現(xiàn)，這一現(xiàn)象符合臨床和其他動(dòng)物腦缺血模型研究中的炎癥變化特點(diǎn)[15-16]。

FeCl3溶液可誘導(dǎo)形成穩(wěn)定的小鼠腦缺血模型，模型動(dòng)物運(yùn)動(dòng)和感覺神經(jīng)功能受損，大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端及術(shù)側(cè)腦表面血流量降低，腦皮層出現(xiàn)組織梗死，梗死周圍可見膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)上調(diào)。本研究建立了穩(wěn)定的腦缺血模型，不僅達(dá)到了腦皮層缺血的實(shí)驗(yàn)需求，而且形成了大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端的血管內(nèi)原位血栓，為后續(xù)藥物溶栓等研究提供了良好的動(dòng)物模型和技術(shù)支撐。

圖6 術(shù)后7 d小鼠腦梗死周圍膠質(zhì)細(xì)胞染色

【點(diǎn)睛】10%氯化鐵溶液誘導(dǎo)血栓生成可制作穩(wěn)定的小鼠腦缺血模型。