云南松松塔對肺纖維化大鼠炎癥因子的作用

李彩虹，李銀蕊，胡 贊，母育成，李春艷，陳俊雅

云南松松塔對肺纖維化大鼠炎癥因子的作用

李彩虹，李銀蕊，胡 贊，母育成，李春艷，*陳俊雅

（大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南，大理 671000）

探討云南松松塔提取物（Extracts from the pinecone of，PE）對肺纖維化大鼠血清炎癥因子水平的影響。SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、陽性組（5 mg/kg醋酸潑尼松龍）及PE高、中、低劑量組（200、100、50 mg/kg）。采用氣管內(nèi)一次性注射0.2 mL博來霉素生理鹽水溶液（5 mg/kg）建立大鼠肺纖維化模型，假手術(shù)組氣管內(nèi)給予0.2 mL無菌生理鹽水。造模后第2 d開始給予相應(yīng)藥物，分別于實(shí)驗(yàn)第7、14、28 d，處死1/3的大鼠，測定大鼠肺系數(shù)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定血清中羥脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）、轉(zhuǎn)化生長因子beta 1（Transform growth factor beta 1，TGF-β1）、腫瘤壞死因子alpha（Tumor necrosis factor alpha，TNF-α）的含量，蘇木素-伊紅（Hematoxylin-eosin，HE）染色考察肺臟組織病理學(xué)變化。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠在第7、14、28 d肺系數(shù)、血清HYP、TGF-β1、TNF-α含量均明顯升高（< 0.05，< 0.01）；與模型組比較，PE中、高劑量組可以不同程度的減小肺系數(shù)（< 0.05，< 0.01），降低血清中TGF-β1、TNF-α及HYP含量（< 0.05，< 0.01）。HE染色顯示PE中、高劑量組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)損傷及炎性細(xì)胞浸潤均較模型組明顯減輕。云南松松塔可以改善博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化大鼠的炎癥反應(yīng)和膠原沉積情況。

肺纖維化；云南松松塔；轉(zhuǎn)化生長因子β1；腫瘤壞死因子α；羥脯氨酸

特發(fā)性肺纖維化（Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種限制性肺間質(zhì)疾病，在其發(fā)展過程中，常伴隨間質(zhì)性肺炎在組織結(jié)構(gòu)上的發(fā)展，成纖維細(xì)胞灶中纖維原細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的積聚，以及炎癥因子浸潤和膠原過度沉積等病理學(xué)改變。病人常因肺泡毛細(xì)管的纖維化而導(dǎo)致呼吸障礙甚至導(dǎo)致死亡[1]，確診后中位生存期僅有2~3年[2]。由于該疾病缺乏有效治療手段，且預(yù)后較差，日益引起學(xué)界重視。

云南松（Franch.）是我國西南林區(qū)的主要樹種之一，主要生長在海拔600~3100 m地帶。云南松松塔是云南松的球果，味甘、苦、性溫、無毒[3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，云南松松塔提取物可降低肺纖維化大鼠肺組織勻漿中丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量，增強(qiáng)總抗氧化能力（Total-antioxidant capacity，T-AOC），從而減輕博來霉素導(dǎo)致的肺纖維化大鼠肺組織氧化應(yīng)激損傷，改善肺組織的彈性、質(zhì)地及腫脹程度[4]。因此本試驗(yàn)采用氣管內(nèi)一次性注射博來霉素建立肺纖維化大鼠模型，通過考察不同時(shí)間點(diǎn)肺纖維化大鼠組織病理學(xué)改變，血清中HYP、TNF-α以及TGF-β1含量的變化，進(jìn)一步探討云南松松塔提取物對肺纖維化大鼠炎癥因子的影響，從而揭示其抗肺纖維化作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

藥材采自云南省大理白族自治州大理市蒼山東坡斜陽峰，經(jīng)大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院劉光明教授鑒定為松科松屬植物云南松的松塔。松塔經(jīng)自然晾干后粉碎，用95%乙醇浸泡3次，1%氫氧化鈉提取，過濾；濾液分別用1倍量、2倍量、5倍量95%乙醇沉淀，合并沉淀物，減壓干燥，得到云南松松塔提取物（Extracts from the pinecone of，PE）。博來霉素（浙江海正輝瑞，批號(hào)：16037911），醋酸潑尼松龍片（上海上藥信誼，批號(hào)：017160801），大鼠TGF-β1 ELISA試劑盒（深圳欣博盛，批號(hào)：R170418-107a），大鼠TNF-α ELISA試劑盒（深圳欣博盛，批號(hào)：R170418-102a），羥脯氨酸測試盒（南京建成，批號(hào)：20170413）。

1.2 動(dòng)物

SPF級(jí)Sprague Dawley（SD）大鼠144只，雌雄各半，體質(zhì)量(180 ± 20) g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2014-0005。試驗(yàn)前，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由飲水飲食。

1.3 儀器

JR-30鼠恒溫實(shí)驗(yàn)臺(tái)（成都泰盟），Biotek全波長酶標(biāo)儀（Biotek公司），EL104電子天平（梅特勒-托利多），萊卡DM2000顯微鏡（德國萊卡），DHP-9272B電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒）。

1.4 方法

1.4.1 模型制備與分組給藥

SD大鼠根據(jù)體重隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、陽性組、PE低、中、高劑量組，每組雌雄各半。實(shí)驗(yàn)前大鼠肌肉注射20%烏拉坦溶液麻醉，固定于大鼠恒溫實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，頸正中部位切口并暴露氣管，除假手術(shù)組外，所有大鼠氣管內(nèi)一次性注入博來霉素（5 mg/kg）溶液0.2 mL，假手術(shù)組注入等量生理鹽水，迅速縫合肌肉層和皮膚層，然后將大鼠直立并輕輕旋轉(zhuǎn)恒溫實(shí)驗(yàn)臺(tái)15 s，以使藥液在肺內(nèi)分布均勻[5]。造模次日開始給藥，陽性組灌胃5 mg/kg醋酸潑尼松龍溶液，PE低、中、高劑量組分別灌胃50、100、200 mg/kg 云南松松塔提取物溶液，模型組灌胃等量生理鹽水，各組均按0. 2 mL/10 g體重連續(xù)給藥，1次/d，假手術(shù)組不給藥，然后分別于實(shí)驗(yàn)第7、14、28 d，分別處死1/3大鼠。

1.4.2 大鼠肺系數(shù)測定

每批大鼠處死后，迅速摘取肺組織，預(yù)冷生理鹽水漂洗污血，濾紙吸干水分并稱重，按照下式計(jì)算肺系數(shù)：肺系數(shù)=肺重（mg）/體重（g）。

1.4.3 血清TGF-β1、TNF-α及HYP含量測定

給藥結(jié)束后，烏拉坦麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，4 ℃條件下3000 rpm離心10 min，取上清，-80 ℃分裝保存，按照試劑盒說明書測定血清中TGF-β1、TNF-α及HYP的含量。

1.4.4 組織病理學(xué)檢查

取大鼠左肺上葉固定于10 %福爾馬林溶液，乙醇脫水，石蠟包埋，4 μm切片，常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察大鼠組織病理學(xué)變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)變化

HE染色發(fā)現(xiàn)（圖1），假手術(shù)組大鼠肺組織切片肺泡結(jié)構(gòu)完整，邊界清晰，肺泡間隔正常，肺泡內(nèi)及肺泡間隔無明顯炎癥細(xì)胞。模型組大鼠肺泡壁急劇增厚，實(shí)變區(qū)增多，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂近乎消失，呈彌漫性肺纖維化，且隨時(shí)間延長纖維化程度逐漸加重。陽性組及PE低、中、高劑量組肺組織有不同程度的肺泡間隔變寬，肺泡結(jié)構(gòu)破壞以及炎性細(xì)胞浸潤，但遠(yuǎn)較模型組輕，PE低劑量組大鼠肺組織在第28 d出現(xiàn)較明顯纖維化。

圖1 大鼠肺組織病理學(xué)變化（HE，×100）

2.2 肺系數(shù)

與假手術(shù)組比較（表1），在第7、14、28 d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，模型組大鼠肺系數(shù)均顯著高于假手術(shù)組（< 0.01）；與模型組比較，陽性組、PE高和中劑量組在第7、14、28 d的肺系數(shù)均降低（< 0.01，< 0.05）。

表1 大鼠肺系數(shù)變化（± s，n = 8）

注：與假手術(shù)組比較，*< 0.05，**< 0.01；與模型組比較，#< 0.05，##< 0.01

2.3 血清TGF-β1含量測定

與假手術(shù)組比較（表2），模型組大鼠血清TGF-β1含量在第7、14、28 d均明顯升高（< 0.05，< 0.01）；與模型組比較，陽性組及PE高、中劑量組大鼠血清TGF-β1含量在第14、28 d明顯降低（< 0.05，< 0.01）。

表2 PE對大鼠血清中TGF-β1含量的影響（± s，n = 8）

注：與假手術(shù)組比較，*< 0.05，**< 0.01；與模型組比較，#< 0.05，##< 0.01

2.4 血清TNF-α含量測定

與假手術(shù)組比較（表3），模型組大鼠血清TNF-α含量在第7、14、28 d均顯著升高（< 0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清TNF-α含量在第7、14、28 d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)（PE低劑量組在第7 d除外）均明顯降低（< 0.05，< 0.01）。

表3 PE對大鼠血清中TNF-α含量的影響（ ± s，n = 8）

注：與假手術(shù)組比較，*< 0.05，**< 0.01；與模型組比較，#< 0.05，##< 0.01

2.5 血清HYP含量測定

與假手術(shù)組比較（表4），模型組大鼠血清HYP含量在第14、28 d明顯升高（< 0.01）；與模型組比較，陽性組、PE高劑量組在第14、28 d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的HYP含量均明顯降低（< 0.01）。

表4 PE對大鼠血清中HYP含量的影響（ ± s，n = 8）

注：與假手術(shù)組比較，*< 0.05，**< 0.01；與模型組比較，#< 0.05，##< 0.01

3 討論

試驗(yàn)采用氣管內(nèi)一次性注射博來霉素建立肺纖維化大鼠模型。博來霉素常作為化療藥物可用于治療癌癥，但具有明顯的肺臟毒性，易導(dǎo)致肺損傷和纖維化等[6]。正常情況下，博來霉素由博來霉素水解酶代謝，但是肺臟中水解酶的缺乏導(dǎo)致肺臟對博來霉素的毒性非常敏感[7]。高濃度博來霉素可以引起DNA鏈斷裂，產(chǎn)生自由基，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激并最終導(dǎo)致細(xì)胞壞死和/或凋亡[8]。前期研究表明，云南松松塔可降低博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠肺組織勻漿MDA含量，提高T-AOC活力，從而減輕氧化應(yīng)激損傷，改善肺組織質(zhì)地及減輕腫脹程度。肺系數(shù)的高低是反映肺纖維化程度、肺實(shí)變的最直觀指標(biāo)之一[9]。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，大鼠模型組在第7、14、28 d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的肺系數(shù)均明顯增大；與模型組比較，各給藥組（PE低劑量組除外）在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的肺系數(shù)均明顯減小，說明肺纖維化模型制備成功。

博來霉素能夠引起大鼠肺組織急性炎癥，促進(jìn)巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的聚集以及成纖維細(xì)胞的激活[10]。肺組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，肺纖維化模型大鼠肺泡壁增厚，結(jié)構(gòu)被破壞，且可見炎性細(xì)胞浸潤及彌漫性肺纖維化，隨時(shí)間延長纖維化程度逐漸加重；與相同時(shí)間點(diǎn)的模型組相比，PE中、高劑量組均表現(xiàn)出肺泡結(jié)構(gòu)損傷及肺泡間隔增厚程度明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤減少，纖維化程度降低。

在肺纖維化進(jìn)程中，核因子kappaB（Nuclear factor-κB，NF-κB）在上皮損傷中發(fā)揮重要作用。它最初釋放一些包括白細(xì)胞介素（Interleukin 1，IL-1）、TNF-α等促炎因子，促進(jìn)炎癥細(xì)胞，例如循環(huán)成纖維細(xì)胞和骨髓間質(zhì)祖細(xì)胞向肺組織趨化。接下來NF-κB激活TGF-β1的表達(dá)，作為肺纖維化進(jìn)程中關(guān)鍵的中間介質(zhì)，TGF-β1可以誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生上皮來源的成纖維細(xì)胞，激活成纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞過度合成膠原，最終導(dǎo)致肺纖維化[11]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，在第7、14、28 d PE中、高劑量組大鼠血清TNF-α含量均明顯降低，第14、28 d血清TGF-β1含量明顯降低，從而在給予PE后使TNF-α等促炎因子的釋放減少以及因NF-κB激活TGF-β1導(dǎo)致的表達(dá)降低。

另外，肺纖維化發(fā)生時(shí)，肺組織內(nèi)增加的主要成分是膠原纖維，而HYP為膠原蛋白所特有，是膠原纖維沉積的代表指標(biāo)，因此HYP能間接反映肺組織中膠原代謝情況[12]。本實(shí)驗(yàn)中，在7、14、28 d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)PE高劑量組大鼠血清HYP含量相比模型組均明顯降低，PE中、低劑量組大鼠血清HYP含量低于模型組，說明云南松松塔能夠減少肺纖維化形成過程中膠原過度合成和沉積。

研究發(fā)現(xiàn)，在云南松松塔中含有大量二萜類化合物[13-14]、酚類化合物[15]、黃酮類[16]及多糖[17]等成分。而這些物質(zhì)具有廣泛的生物活性，如二萜類化合物的抗炎[18]、保肝[19]、抗腫瘤[20]等作用。在本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，給予肺纖維化模型大鼠不同劑量云南松松塔提取物之后，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，高、中劑量松塔提取物均能降低大鼠血清中促炎因子TNF-α含量，并減少血清中促纖維化因子TGF-β1的含量，說明松塔抗纖維化作用的發(fā)揮可能與減輕促炎因子分泌有關(guān)。

根據(jù)《本草綱目》記載，云南松松塔具有祛痰、止咳、平喘等功效，說明其在呼吸系統(tǒng)疾病方面早有應(yīng)用。文獻(xiàn)報(bào)道云南松松塔不同極性部位對不同狀態(tài)豚鼠離體氣管平滑肌具有解痙作用，對腸鼠靜息和致痙離體氣管平滑肌有松弛作用[21]。同時(shí)本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，云南松松塔提取物可以改善大鼠病理狀態(tài)，減少促纖維化因子TGF-β1釋放和促炎因子TNF-α的釋放，從而延緩肺纖維化進(jìn)程，表明云南松松塔提取物具有一定的抗肺纖維化作用，這種作用主要與減少炎癥因子TNF-α的釋放、降低TGF-β1的表達(dá)以及減少膠原過度沉積有關(guān)。

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EFFECT OF THE PINECONE OFON INFLAMMATORY FACTORS IN RATS WITH PULMONARY FIBROSIS

LI Cai-hong, LI Yin-rui, HU Zan, MU Yu-cheng, LI Chun-yan,*CHEN Jun-ya

(College of Pharmacology and Chemistry, Dali University, Dali, Yunnan 671000, China)

To study the effects of the extracts from pinecone ofon inflammatory factors of rats with pulmonary fibrosis.SD rats were randomly divided into sham-operated group, model group, positive group (5 mg/kg prednisolone) and PE high, middle and low dosage groups (200, 100, 50 mg/kg). The pulmonary fibrosis model was established by intratracheally administration 0.2 mL bleomycin (5 mg/kg), and the rats in sham-operated group were given 0.2 mL normal saline. The corresponding drugs were administrated to the rats from the 2ndday, and then the 1/3 rats in each group were sacrificed to the 7th, 14thand 28thd, respectively. Finally, the lung index was determined. The contents of HYP, TGF-β1, TNF-α in serum were determined through ELISA, and histopathological change was investigated by HE staining.The lung index, contents of HYP, TGF-β1, TNF-α in serum of rats in model group were significantly increased (< 0.05,< 0.01) compared with sham-operated group. Compared with the model group, the lung index, the contents of TGF-β1, TNF-α and HYP in PE high and middle dose groups decreased apparently (< 0.05,< 0.01). Histopathological sections showed damaged alveolar structure and inflammatory cells infiltration were alleviated in PE middle and high groups compared with the model group.The pinecone ofcould ameliorate lung fibrosis, inflammatory response and collagen deposition in rats with pulmonary fibrosis induced by bleomycin.

pulmonary fibrosis; pinecone of; transform growth factor β1; tumor necrosis factor α; hydroxyproline

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2020.05.016

1674-8085(2020)05-0092-06

2020-02-26；

2020-04-17

云南省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究青年項(xiàng)目（2017FD137）；大理大學(xué)大學(xué)生科研基金項(xiàng)目(KYSX201682)

李彩虹(1996-)，女，青海西寧人，大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院藥學(xué)專業(yè)2014級(jí)本科生(E-mail:3142936275@qq.com);

李銀蕊(1997-)，女，云南昆明人，大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院藥理學(xué)專業(yè)2019級(jí)研究生(E-mail:18760968074@163.com);

胡 贊(1996-)，男，陜西漢中人，大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院藥學(xué)專業(yè)2014級(jí)本科生(E-mail:1135468696@qq.com);

母育成(1996-)，男，四川廣元人，碩士生，主要從事中藥藥理學(xué)研究(E-mail:1281635327@qq.com);

李春艷(1982-)，女，云南臨滄人，講師，碩士，主要從事中藥藥理學(xué)研究(E-mail:lcyyanyan@126.com);

* 陳俊雅(1986-)，男，河南周口人，實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事中藥藥理學(xué)研究(E-mail:langcjy@126.com).