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    CNV-Seq聯合核型分析在羊水穿刺胎兒染色體嵌合體診斷中的應用

    2020-11-27 09:22:04徐晶晶彭亞琴宋雅嫻何國平湯冬冬
    安徽醫(yī)學 2020年10期
    關鍵詞:嵌合體核型羊水

    劉 文 徐晶晶 彭亞琴 胡 月 宋雅嫻 何國平 湯冬冬 汪 菁

    羊水細胞染色體核型嵌合比例、類型、發(fā)生位置的不同對胎兒臨床表型的影響不可預知,如何精準評估“嵌合體”,并對孕婦是否繼續(xù)妊娠提供準確的遺傳咨詢,是目前臨床工作中的重點和難點問題[1-2]。染色體核型嵌合存在真性嵌合和假性嵌合2種可能,難以判斷,雖然真性、假性嵌合的診斷標準明確,但嵌合體診斷的靈敏度和準確度仍有待提高。染色體核型分析是診斷染色體異常較為公認的“金標準”,但是使用該方法診斷染色體嵌合體,依然存在漏診、誤診的可能,研究[3-4]認為染色體核型分析提示嵌合的孕婦并不應立即終止妊娠,建議使用其他檢測技術進一步驗證。

    近年來,隨著細胞生物學、分子生物學技術的不斷進步,尤其是基因組拷貝數變異測序技術(copy number variation sequencing,CNV-Seq)日益廣泛地應用于產前診斷,已對胎兒染色體嵌合的靈敏、特異診斷起到了積極的作用。本研究擬通過回顧性分析穿刺羊水標本雙線培養(yǎng)、制片、G帶核型分析及聯合應用CNV-Seq技術進行嵌合體診斷的準確性,并進一步明確不同產前診斷指標異常孕婦羊水中染色體核型的嵌合情況,探討2項技術聯合在胎兒染色體嵌合體診斷中的臨床應用。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料 選擇2018年1月至2019年9月在中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院婦產科產前診斷中心行常規(guī)產前診斷的孕婦為研究對象。納入標準:單胎妊娠,無妊娠感染及其他合并癥。排除標準:孕婦本人或配偶染色體異常,精神疾病患者。本研究共納入3 320位孕婦,年齡21~37歲,孕周18~24周,均簽署產前診斷(含CNV-Seq)知情同意書。其羊水標本均通過羊膜腔穿刺術順利獲取,分別用于染色體核型分析和CNV-Seq。

    1.2 方法

    1.2.1 經腹B超引導下羊膜腔穿刺術 采用21 G穿刺針連接注射器抽取1~2 mL孕婦羊水后棄去,以避免母體細胞污染,改換注射器繼續(xù)抽取清亮羊水約25 mL,按順序分裝至I、II、III號管,I、III號管分別留取約10 mL羊水用于細胞培養(yǎng),II號管留取約5 mL羊水用于CNV-Seq。

    1.2.2 羊水核型分析 ①培養(yǎng)、制片:I、III號管分兩線獨立操作,分別接種后第2天加液2 mL,1周換液,顯微鏡下監(jiān)測細胞生長狀態(tài),8~10 d后使用原位法收獲細胞并制片,G顯帶染色后,使用徠卡GSL-120自動掃描儀記錄信息。②閱片分析:兩線分別計數不少于15個細胞、分析不少于3個細胞,觀察、記錄染色體數目及結構情況。按照國家衛(wèi)生健康委員會制定的羊水細胞嵌合體真實性評估及處理規(guī)則[5],必要時擴大細胞計數并增加核型分析數量。

    1.2.3 CNV-Seq檢測 將II號管羊水標本離心沉淀后,提取50 ng基因組DNA作為模板構建測序文庫,使用BGISEQ-500測序儀進行低深度高通量測序,記錄染色體非整倍體變異及100 kb以上的CNV并進行分析。CNV結果的臨床評價基于美國醫(yī)學遺傳學會(American College of Medical Genetics,ACMG)指南,突變命名參考國際系統標準[6-7]。

    1.3 隨訪 對羊水核型或CNV-Seq檢測結果提示為胎兒染色體嵌合體的孕婦提供遺傳咨詢,并對活產胎兒進行隨訪。

    2 結果

    2.1 胎兒染色體嵌合體檢出率 3 320例羊水標本中,CNV-Seq聯合G帶核型分析共檢測出胎兒染色體嵌合體19例(嵌合檢出率為0.57%),其中核型檢測出16例(嵌合檢出率為0.48%),CNV-Seq檢測出12例(嵌合檢出率為0.36%)。2種方法均檢測出的嵌合體共有9例,值得注意的是,3例核型分析未嵌合的標本,CNV-Seq檢測出嵌合,后經熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)驗證為真嵌合。見表1。

    表1 核型分析和CNV-Seq嵌合結果

    2.2 不同產前診斷指征孕婦羊水染色體嵌合結果 在不同產前診斷指標異常的孕婦羊水標本中,無創(chuàng)產前檢測(non invasive prenatal testing, NIPT)提示異常的孕婦羊水中檢出嵌合體8例,超聲、胎兒頸項透明膜(nuchal translucecy, NT)厚度提示異常的孕婦羊水標本中檢出嵌合體5例,高齡孕婦羊水標本中檢出嵌合體2例,唐氏篩查結果提示高風險的孕婦羊水標本中檢出嵌合體4例。見表2。

    表2 核型分析及CNV-Seq檢測不同產前診斷指征孕婦羊水染色體嵌合結果(例)

    2.3 胎兒染色體異常嵌合類型 核型分析聯合CNV-Seq檢測為嵌合體的病例中,性染色體數目或結構異常9例,常染色體數目、結構異常的分別為9例和1例。其中有3例性染色體和7例常染色體異常嵌合的病例,核型分析與CNV-Seq檢測結果不一致。見表3。

    表3 核型分析及CNV-Seq檢測出的異常嵌合類型(例)

    3 討論

    準確鑒別胎兒染色體是否存在嵌合體以及嵌合的性質,對決定孕婦的妊娠結局尤為關鍵。嵌合體的形成原因多種多樣,例如:在合子卵裂過程中或胚胎早期體細胞突變,此時每一條染色體都可能畸變,形成染色體數目、結構異常的真性嵌合體。然而,特定情況下,多種因素也會導致假性嵌合現象,假性嵌合需通過進一步檢測來確認[8]。有學者提出在妊娠早期絨毛膜或中期羊水中若發(fā)現嵌合,不應立即終止妊娠,應行臍血穿刺術或羊膜腔穿刺術,并使用其他檢測技術進一步證實胎兒染色體異常,例如:結合超聲診斷技術對胎兒進行觀察,并考慮運用蛋白質組學技術篩查產前診斷生物標志物[9],如選擇繼續(xù)妊娠并活產胎兒,在胎兒出生后還應檢測多個組織、加強隨訪[10]。

    染色體核型分析是診斷染色體異常較為公認的“金標準”,但是診斷低比例染色體嵌合體,以及在區(qū)分真性、假性嵌合過程中仍然存在明顯不足,迫切需要其他檢測方法的聯用,輔助診斷胎兒染色體嵌合體,以期更加準確地區(qū)分真、假嵌合,實現靈敏、特異診斷[3]。

    CNV-Seq是一項近年來興起的高通量測序技術,具有操作簡單、周期短、通量高、檢測范圍廣等優(yōu)勢,彌補了核型分析染色體結構性變異分辨率大于10 Mb的不足[11-12]。CNV-Seq可以在分子水平上檢測出形態(tài)學觀察不易發(fā)現的染色體微缺失、微重復,還可以輔助檢測嵌合比例,發(fā)現核型分析無法診斷的低比例嵌合,同時避免取材誤差或體外培養(yǎng)、收獲、制片等人為操作造成的假性嵌合診斷,從而能夠更準確地輔助臨床進行遺傳咨詢[13]。

    本研究采用的嵌合體檢測方案是穿刺羊水標本行染色體G帶核型分析聯合CNV-Seq分子檢測,結果顯示核型分析胎兒染色體嵌合檢出率為0.48%,CNV-Seq嵌合檢出率為0.36%,2種方法聯用的嵌合檢出率為0.57%,CNV-Seq聯合核型分析提高了胎兒染色體嵌合體診斷的陽性檢出率,與既往文獻[14]報道的羊水嵌合體檢出率(0.3%)基本吻合。值得注意的是,3例核型分析無明顯嵌合的標本,CNV-Seq檢測出真性嵌合,由此可見,穿刺取材、細胞培養(yǎng)、制片等實驗操作及人工分析引起的系統誤差,導致核型分析出現漏檢不可避免,而CNV-Seq作為輔助檢測手段,可以較好地彌補核型分析的劣勢[15-16]。在檢出嵌合體的病例中,對應的產前診斷指標異常包括:NIPT異常、超聲或NT厚度異常、孕婦高齡及唐氏篩查高危等,表明隨著分子遺傳學的快速發(fā)展、超聲診斷學的不斷進步,常規(guī)產前檢查一定程度上提高了胎兒染色體嵌合體的陽性檢出率。此外,在檢出的10例染色體嵌合體中,核型分析與CNV-Seq檢測結果不一致,可能的原因是核型分析的是經過體外培養(yǎng)的羊水細胞,而CNV-Seq檢測的是未經體外培養(yǎng)的羊水細胞,且二者對于低比例嵌合的檢測靈敏度不同。

    CNV-Seq雖然可以提高羊水穿刺產前診斷中胎兒嵌合體的診斷率,但由于其技術局限性,目前尚無法判斷遺傳物質總量不變的情況下染色體結構異常,如上述1例羅氏易位嵌合,CNV-Seq尚無法辨別。此外,在性染色體嵌合病例中,CNV-Seq雖能檢測到異常,但對結果更精準的解讀尚需聯合核型分析。

    綜上所述,對于NIPT、超聲[17-19]等產前篩查中發(fā)現的高危妊娠,CNV-Seq聯合常規(guī)G帶染色體核型分析可以彌補單一檢測方法診斷羊水穿刺胎兒染色體嵌合體出現誤診的不足,,且有助于發(fā)現染色體低比例嵌合及微缺失、微重復,為產前遺傳咨詢提供了更加可靠的實驗室診斷結果。

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