右美托咪定對快速心房起搏后兔心房電生理學(xué)特性及Cx43 Cx40表達(dá)的影響

朱承選 張東亞

右美托咪定是一種新型高效選擇性α2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑，多用于圍術(shù)期鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜。研究[1-2]發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可明顯減少心臟手術(shù)術(shù)后房顫(postoperative atrial fibrillation，POAF)的發(fā)生率,其機(jī)制有待進(jìn)一步探討。POAF是心臟手術(shù)術(shù)后的一種常見并發(fā)癥，具有較高的致死率和致殘率，其發(fā)病率為20%～40%[3]。右美托咪定具有心肌保護(hù)作用，可抑制心肌缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI)后心律失常的發(fā)生[4-5]，但右美托咪定能否在房顫時(shí)介導(dǎo)房顫的發(fā)生和維持，目前尚不清楚。本研究通過短期快速心房起搏構(gòu)建房顫模型，研究右美托咪定在房顫時(shí)對心房電生理學(xué)特性和Cx43、Cx40表達(dá)的影響，探討其減少房顫發(fā)生的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年新西蘭雄兔24只，體質(zhì)量1.5～2 kg,由清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供(動(dòng)物合格證號：62009800001228)，于恒溫、恒濕環(huán)境飼養(yǎng)48 h,自由獲取食物和水。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為C組、RAP組和RAP+DEX組，每組8只。

1.2 試劑與儀器 K-H液：NaCl 6.92 g、NaHCO32.1 g、KCl 0.35 g、KH2PO40.16 g、MgSO4·7H2O 0.29 g、葡萄糖 2.0 g、CaC120.2 g、蒸餾水1 000 mL,PH 7.35～7.45(國產(chǎn)分析純)；兔抗-Cx40多克隆抗體(Abcam公司，英國)；鼠抗-Cx43單克隆抗體(Santa Cruz公司，美國)；總蛋白提取試劑盒(Vazyme公司，美國)；ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(Invitrogen公司，美國)；BPA多導(dǎo)生理記錄儀(Hugo公司，德國)；IH-5 Langgendoff灌流裝置(Hugo公司，德國)；激光共聚焦顯微鏡(zeiss公司，德國)；DF-5A電生理刺激儀(蘇州東方電子儀器廠，中國)。

1.3 Langgendoff離體心臟模型制備、給藥 家兔術(shù)前0.5 h予腹腔注射肝素鈉400 IU/kg抗凝，經(jīng)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉，待無睫毛反射與疼痛反射后，迅速開胸取心，置于4℃K-H液中停跳，修剪心臟、暴露主動(dòng)脈并插管，連接IH-5 Langgendoff灌流裝置進(jìn)行主動(dòng)脈逆行恒壓灌注。Langgendoff灌流裝置中，K-H液以95% O2和5% CO2混合氣體飽和，溫度維持在37℃左右，灌注壓維持在60 mmHg左右。分別將EGM電極固定于左右心房壁及心尖，使其緊貼心肌表面，刺激電極固定于右心耳，MAP電極固定于左心房側(cè)壁，連接多導(dǎo)生理記錄儀、DF-5A電生理刺激儀，待心臟穩(wěn)定復(fù)跳15 min(T0)后開始實(shí)驗(yàn)，3組分別于灌注第60(T1)、120(T2)和180 分鐘(T3)時(shí)記錄90%單相動(dòng)作電位時(shí)程(monophasic action potential duration，MAPD90)，最后留取左心房組織。C組：繼續(xù)灌注K-H液180 min。RAP組:繼續(xù)灌注K-H液180 min，同時(shí)予快速心房起搏(600次/分，脈寬2 ms, 電壓為2倍閾電位)。RAP+DEX組：繼續(xù)灌注含右美托咪定50 ng/mL的K-H液180 min，同時(shí)予快速心房起搏。

1.4 電生理參數(shù)測定 繼續(xù)灌注180 min后，以S1S2程序刺激法檢測心房有效不應(yīng)期(effective refractory period,ERP)，S1S2偶聯(lián)間期從基礎(chǔ)刺激周長300 ms開始，刺激比例8∶1,脈寬2 ms，步長-10 ms,刺激電壓為2倍閾電位，至S2不能奪獲心房的最長S1S2間期為ERP,重復(fù)3次，取平均值。記錄T3時(shí)ERP和MAPD90的比值(ERP/MAPD90)。待恢復(fù)竇率后，行周長為100 ms的Burst刺激，持續(xù)30 s，共30次，當(dāng)心房出現(xiàn)不規(guī)則電活動(dòng)時(shí)間>2 s即認(rèn)為誘發(fā)出房顫，記錄3組的房顫誘發(fā)率和持續(xù)時(shí)間。

1.5 Western-blot法檢測心房肌細(xì)胞Cx43、Cx40總蛋白的表達(dá) 將凍存左心房組織用液氮研磨，均漿，加入RIPA裂解液，再加入苯甲基磺酰氟提取總蛋白，用BCA法行蛋白濃度測定。取待測蛋白樣品50 μg，完成SDS-PAGE，轉(zhuǎn)到NC膜上。5%脫脂奶粉緩沖液溫室封閉1 h,加入稀釋的Cx43、Cx40抗體及GAPDH單克隆抗體，4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液清洗后，溫室下加相應(yīng)Ⅱ抗(1∶10 000)孵育2 h,洗滌瀝干后，加入ECL Plus試劑進(jìn)行ECL顯影。最后用圖像分析軟件Labworks測定圖片上每個(gè)特異性條帶灰度值。

1.6 免疫熒光法檢測心房肌細(xì)胞Cx40、Cx43表達(dá)及分布 取左心房組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片，脫蠟后組織抗原微波修復(fù)，磷酸鹽緩沖溶液漂洗3次，固定，破膜，BSA 37%℃封閉30 min，滴加Ⅰ抗(1∶1 000)，置于37℃濕盒內(nèi)孵育2 h,磷酸鹽緩沖溶液漂洗3次，4’,6-二脒基-2-苯基吲哚染色，磷酸鹽緩沖溶液清洗，封片，激光共聚焦顯微鏡掃描觀察。

2 結(jié)果

2.1 3組不同時(shí)間點(diǎn)MAPD90比較 T1～T3時(shí)，3組MAPD90比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RAP組MAPD90隨時(shí)間的推移有逐漸下降趨勢，組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組和RAP+DEX組MAPD90均較T0時(shí)無明顯變化，組內(nèi)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同的處理方式和時(shí)間對MAPD90有交互作用(P<0.05)。見表1。

表1 3組不同時(shí)間點(diǎn)MAPD90比較

2.2 3組T3時(shí)ERP和ERP/MAPD90比較 T3時(shí)，3組ERP和ERP/MAPD90進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RAP組ERP和ERP/MAPD90均低于C組和RAP+DEX組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組T3時(shí)ERP和ERP/MAPD90比較

2.3 3組房顫誘發(fā)率和持續(xù)時(shí)間比較 3組房顫誘發(fā)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RAP組房顫誘發(fā)率高于C組和RAP+DEX組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3組房顫持續(xù)時(shí)間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 3組房顫誘發(fā)率和持續(xù)時(shí)間比較

2.4 心房肌細(xì)胞Cx43、Cx40蛋白表達(dá)情況比較 3組心房肌細(xì)胞Cx43、Cx40蛋白表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RAP組Cx43、Cx40蛋白含量低于C組和RAP+DEX組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4、圖1。

表4 3組心房肌細(xì)胞Cx43、Cx40蛋白表達(dá)情況比較

圖1 心房肌細(xì)胞Cx43、Cx40蛋白表達(dá)情況

2.5 心房肌細(xì)胞Cx40、Cx43的表達(dá)與分布 C組：Cx40、Cx43表達(dá)清楚，主要位于心肌閏盤處，呈端—端條狀分布，少量分布于心肌細(xì)胞側(cè)面。RAP組：Cx40、Cx43表達(dá)明顯減少，分布無規(guī)律，呈點(diǎn)狀分布，側(cè)面分布增多。RAP+DEX組：Cx40、Cx43表達(dá)相對減少，分布與對照組類似，僅少量分布于心肌側(cè)面。見圖2。

圖2 心房肌細(xì)胞Cx40、Cx43的表達(dá)和分布(×400)

3 討論

POAF是心臟手術(shù)術(shù)后常見并發(fā)癥，是引起術(shù)后心力衰竭、血栓形成的重要原因[3]，降低POAF的發(fā)生將有益于改善患者預(yù)后。臨床研究[1-2,4-7]發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可明顯減少POAF的發(fā)生率，其機(jī)制可能與右美托咪定穩(wěn)定心臟電活動(dòng)、上調(diào)連接蛋白表達(dá)等有關(guān)。研究[8]表明，短期快速心房起搏即可引起心房重構(gòu)，導(dǎo)致心房ERP和動(dòng)作電位時(shí)程縮短、Cx43和Cx40表達(dá)下調(diào)，增加心臟對房顫的易感性和持續(xù)性。本實(shí)驗(yàn)采用快速心房起搏構(gòu)建房顫模型，觀察右美托咪定在房顫時(shí)對兔心房電生理學(xué)特性和Cx43、Cx40表達(dá)的影響，探討其抑制房顫發(fā)生的機(jī)制。

本研究RAP+DEX組較RAP組的ERP、 MAPD90明顯延長，ERP/MAPD90的比值明顯增大，與相關(guān)研究[6-7]結(jié)果一致，表明右美托咪定對心臟電生理活動(dòng)具有穩(wěn)定作用。ERP/MAPD90的比值反映心肌電異質(zhì)性，ERP/MAPD90的比值越大，心肌電異質(zhì)性越小，越不易形成心律失常。心房ERP和MAPD90的非同步性變化引起電異質(zhì)性改變是房顫的機(jī)制之一[9]。本研究中，右美托咪定可明顯抑制快速心房起搏引起的心房電重構(gòu)，減少了心肌電異質(zhì)性。房顫誘發(fā)率是衡量心房電穩(wěn)定性重要指標(biāo)，RAP+DEX組較RAP組房顫誘發(fā)率明顯降低，進(jìn)一步表明右美托咪定在房顫時(shí)對心房電活動(dòng)具有穩(wěn)定作用，降低了房顫的易感性。Cx43、Cx40是構(gòu)成心房肌細(xì)胞信號傳導(dǎo)的主要成分，其表達(dá)和分布變化時(shí)會(huì)引起心房電激動(dòng)傳導(dǎo)速度和傳導(dǎo)方向發(fā)生改變[10]。研究[11]發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可抑制IRI后的心肌復(fù)極不均一性，穩(wěn)定心肌電傳導(dǎo)，降低復(fù)灌性心律失常的發(fā)生，其機(jī)制可能與右美托咪定抑制縫隙連接蛋白失偶聯(lián)、抑制Cx43表達(dá)減少及分布紊亂有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，RAP+DEX組較RAP組Cx43、Cx40表達(dá)明顯上調(diào)，且分布更規(guī)律，表明右美托咪定可抑制房顫時(shí)心房肌細(xì)胞Cx43、Cx40的表達(dá)下調(diào)和再分布，這可能是右美托咪定抑制房顫發(fā)生的機(jī)制之一。

房顫與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)，氧自由基和炎癥介質(zhì)的增加均可引起心房肌細(xì)胞變性、纖維化，改變心肌細(xì)胞電生理特性，增加房顫的易感性[3]。右美托咪定和其他α2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑一樣，具有抗氧化應(yīng)激、抗炎癥反應(yīng)等作用，在一定程度上有助于抑制房顫的發(fā)生[4,12]，Cx43及Cx40表達(dá)的變化同樣與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)[13]。本研究中，右美托咪定可明顯抑制快速心房起搏后的心房電重構(gòu)、Cx43和Cx40的表達(dá)下調(diào)和再分布，提示右美托咪定抑制房顫的機(jī)制可能與其抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)，但仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，右美托咪定可抑制房顫時(shí)的心房電重構(gòu)，降低房顫的易感性，其機(jī)制可能與其抑制Cx43、Cx40的表達(dá)下調(diào)和再分布有關(guān)。