烏魯木齊人群藥物性耳聾患者M(jìn)T-RNR1基因突變頻譜分析

王 校

(上海中優(yōu)醫(yī)藥高科技有限公司,上海 200433)

耳聾是最常見(jiàn)的殘疾之一，據(jù)WHO估計(jì)，2005年全球有2.78億人患有中度以上聽(tīng)力損失，其中2/3在發(fā)展中國(guó)家。中國(guó)有13億人口，據(jù)2006年第二次殘疾人抽樣調(diào)查顯示，我國(guó)聽(tīng)力和言語(yǔ)殘疾患者高達(dá)2 780萬(wàn)人，其中7歲以下聾兒高達(dá)80多萬(wàn)，其中30多萬(wàn)是由于抗生素使用不當(dāng)所導(dǎo)致，占總體聾啞兒童的30%～40%[1]。氨基糖苷類(lèi)抗生素(aminoglycoside antibiotics，AmAn)主要是通過(guò)損害前庭蝸神經(jīng)(包括前庭和耳蝸)，從而對(duì)患者聽(tīng)力損失。氨基糖苷類(lèi)藥物是通過(guò)與細(xì)菌核糖體結(jié)合，干擾細(xì)菌蛋白合成而發(fā)揮抗菌活性的。人類(lèi)線粒體DNA的基因變異使其更類(lèi)似于細(xì)菌核糖體，更易與氨基糖苷類(lèi)藥物結(jié)合。由于氨基糖苷類(lèi)藥物在內(nèi)耳聽(tīng)細(xì)胞中半衰期較長(zhǎng)(數(shù)月)，因此，一旦內(nèi)耳聽(tīng)細(xì)胞線粒體核糖體與藥物結(jié)合，將引起持久、嚴(yán)重的耳毒性[2]。目前，研究得較多的具有代表性的線粒體DNA突變包括12SrRNA基因上的961insC、961delT/T961G、T1095C、C1494T、A1555G等的突變[3]。這些突變可以是遺傳的，也可以是獲得性的，可以是同質(zhì)的也可以是異質(zhì)的。12S rRNA 1555A>G和1494C>T突變只在部分聽(tīng)力損失的人群中檢測(cè)到[4]，推測(cè)存在其他與耳聾相關(guān)的基因突變位點(diǎn)。鑒于目前鮮見(jiàn)我國(guó)少數(shù)民族人群耳聾相關(guān)基因突變位點(diǎn)的報(bào)道，本研究對(duì)新疆烏魯木齊少數(shù)民族集聚地區(qū)開(kāi)展MT-RNR1基因的篩查，旨在為繪制少數(shù)民族人群非綜合征型耳聾患者的線粒體MT-RNR1基因突變頻譜提供可靠信息。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象和聽(tīng)力學(xué)檢查 我們?cè)?012年1月至2012年12月對(duì)999例來(lái)自中國(guó)新疆烏魯木齊地區(qū)的人群進(jìn)行了詳細(xì)的病史調(diào)查和體檢，以確定是否有耳聾或聽(tīng)力下降的臨床表現(xiàn)、是否有氨基糖苷類(lèi)抗生素的接觸史以及是否有MT-RNR1基因上的堿基突變。研究對(duì)象全部按照中國(guó)優(yōu)生優(yōu)育協(xié)會(huì)倫理委員會(huì)管理規(guī)定簽署了知情同意書(shū)。將聽(tīng)力損失的嚴(yán)重程度根據(jù)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類(lèi)：① 聽(tīng)力正常：≤25 dB；② 輕度聽(tīng)力損失：26～40 dB；③ 中度聽(tīng)力損失：41～70 dB；④ 重度聽(tīng)力損失：71～90 dB；⑤ 極重度聽(tīng)力損失：>90 dB。

1.2 線粒體MT-RNR1基因突變檢測(cè)

1.2.1 硅膠吸附法提取基因組DNA 首先收集研究對(duì)象的口腔黏膜細(xì)胞，冷凍保存；實(shí)驗(yàn)室取出裝有口腔拭子離心管解凍，旋渦震蕩器上震蕩10～20 s，離心12 000 rmp 2 min；去上清，加入1 ml DNA裂解液，混勻；加入50 μl硅膠制劑，混勻，離心10 000 rmp，10 s；去上清及拭子頭，加入1 ml DNA裂洗液，混勻，離心10 000 rmp，10 s；去上清，加入1ml DNA裂解液，混勻，離心10 000 rmp，10 s；去上清，加75%乙醇洗滌兩遍，離心；去上清，加入丙酮，干燥硅膠顆粒；加入純水溶解，離心12 000 rmp 3 min，取上清液50 μl用于后續(xù)檢測(cè)。取5 μl樣本1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果標(biāo)化樣本到10 ng/μl。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 采用在線軟件Primer 3設(shè)計(jì)PCR引物用于擴(kuò)增線粒體DNA MTRNR1上包含961-1555位點(diǎn)的片段。引物序列如下：正向引物：5’-AAAACGCTTAGCCTAGCCACA-3’反向引物：5’-GGTTTAGCTCAGAGCGGTCAA-3’反應(yīng)體系(15 μl)包含1x HotStar Taq buffer，3.0 mM Mg2+，0.3 mM dNTP，1 U HotStarTaq polymerase，2 μl樣本DNA和正、反向引物各0.5 μl(濃度為10 μM)；在ABI 2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。5 μl PCR與1 μl 6×loading buffer混勻，1%瓊脂糖凝膠，1×TAE電泳緩沖液，120 V電泳20 min，marker為DL2000，目的條帶在898 bp左右。

1.2.3 PCR產(chǎn)物純化 反應(yīng)體系包含1U SAP酶、1U Exo I酶和3ul PCR產(chǎn)物組成；反應(yīng)條件為：37℃ 60min，80℃ 15min，4℃恒溫保存；

1.2.4 測(cè)序反應(yīng) 反應(yīng)體系(5μl)包含1μl BigDye、1μl 測(cè)序引物(5’-GGTTTAGCTCAGA GCGGTCAA-3’)(濃度為3 μM)、1 μl PCR純化產(chǎn)物和2 μl去離子水組成；反應(yīng)條件為預(yù)熱96℃、2 min；再進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的96℃ 10 s、50℃ 5 s、60℃、4 min； 4℃恒溫保存；反應(yīng)結(jié)束后每孔加入1 μl 125 mM乙二胺四乙酸EDTA和無(wú)水乙醇15 μl，室溫沉淀15min；3 650 rmp/min，4℃離心30 min，輕輕倒去上清液；每孔加30 μl 70%乙醇，3 650 rmp/min，4℃離心15 min，倒去上清液；室溫放置20 min后加入8 μl 95%甲酰胺與ddH2O混合物，95℃變性5 min后上ABI3130XL測(cè)序儀，用軟件Chromas查閱測(cè)序檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 研究對(duì)象的人口學(xué)特征 999例中，漢族人有529人，維吾爾族人有295人，回族有123人，哈薩克族44人，蒙古族4人，俄羅斯族2人，東鄉(xiāng)族和土族各1人。男性425例, 女性574例；最小年齡1歲，最大年齡79歲，平均18歲。73人(7.3%)有氨基糖苷類(lèi)藥物接觸史，537人(53.8%)未接觸氨基糖苷類(lèi)藥物，389人(38.9%)不清楚自己的藥物接觸史。經(jīng)過(guò)聽(tīng)力學(xué)檢測(cè)，共有508人患有耳聾(占50.9%)，491人沒(méi)有患病。耳聾患者分別表現(xiàn)不同程度的聽(tīng)力損失：186人(18.6%)為極重度聽(tīng)力損失，111人(11.1%)為重度聽(tīng)力損失，62人(6.2%)為中度聽(tīng)力損失，17人(1.7%)為輕度聽(tīng)力損失，132人(13.2%)的頭顱損失情況不明。

2.2 線粒體DNA MTRNR1基因突變分析 共有109例樣本的MT-RNR1基因上共發(fā)現(xiàn)11個(gè)位點(diǎn)發(fā)生堿基改變，即：961 delT/insC、C1494T、A1555G、T1095C、A1116G、T1005C、G1007A、T1107C、A1047G、A1585G、T1520C，攜帶率為10.91%。位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果詳見(jiàn)圖1-12，突變位點(diǎn)及人數(shù)情況詳見(jiàn)表1。

圖1 MTRNR1(正常)

圖2 MTRNR1 961 delT/insC

圖3a MTRNR1 T1095C T

圖3b MTRNR1 T1095C C

圖4a MTRNR1 C1494T C

圖4b MTRNR1 C1494T T

圖5a MTRNR1 A1555G A

圖5b MTRNR1 A1555G G

圖6a MTRNR1 A1585G A

圖6b MTRNR1 A1585G G

圖7a MTRNR1 A1047G A

圖7b MTRNR1 A1047G G

圖8a MTRNR1 A1116G A

圖8b MTRNR1 A1116G G

圖9a MTRNR1 T1520C T

圖9b MTRNR1 T1520C C

圖10a MTRNR1 G1007A G

圖10b MTRNR1 G1007A A

圖11a MTRNR1 T1107C T

圖11b MTRNR1 T1107C C

圖12a MTRNR1 T1005C T

圖12b MTRNR1 T1005C C

表1MT-RNR1基因的11個(gè)突變位點(diǎn)及人數(shù)情況

位點(diǎn)受累人數(shù)重度/極重度人數(shù)接觸AmAn且重度/或極重度耳聾人數(shù)少數(shù)民族人數(shù)961 delT/insC11316C1494T2110A1555G221152T1095C3002A1116G2001T1005C21618G1007A1111T1107C4310316A1047G1000A1585G2002T1520C1000

3 討 論

A1555G突變被認(rèn)為是世界上跟耳聾相關(guān)的最顯著線粒體DNA突變，并已在白種人和亞洲人等不同人群中得以確定，且跟線粒體單倍型類(lèi)群相關(guān)[4-5]。這種突變?cè)趤喼奕巳褐械陌l(fā)生更加普遍，在亞裔人群藥物性耳聾患者中，1555A>G突變頻率為5%～33%[6]，而國(guó)內(nèi)報(bào)道的mtDNA A1555G突變陽(yáng)性率是3.43%[7]，但在我國(guó)西北地區(qū)線粒體DNA 12SrRNA A1555G突變檢出率顯著高于東北地區(qū)[8]。本次研究的1555A>G基因突變頻率為4.33%，與國(guó)內(nèi)報(bào)道相似。

C1494T突變的發(fā)生率遠(yuǎn)低于A1555G突變對(duì)線粒體。有研究顯示，在621例耳聾患者中共篩查出2例mtDNA C1494T突變個(gè)體，頻率為0.32%[9]。1494C>T突變頻率在本研究的研究對(duì)象者中占0.39%，與以往研究結(jié)果相似。位于12SrRNA高度保守的解碼區(qū)的同質(zhì)性的C1494T突變與耳聾相關(guān)。12SrRNA基因功能有影響的核修飾基因可能會(huì)使C1494T突變的生化缺陷增強(qiáng)，使該突變攜帶者聽(tīng)力下降，而這種核修飾基因也可以抑制該突變的作用而使該成員聽(tīng)力正常[10]。

本研究顯示961 delT/insC基因突變頻率達(dá)2.17%。Bacino等[11]首次報(bào)道m(xù)tDNA 961delT/insC與藥物性耳聾相關(guān)，并指出線粒體12SrRNA基因的第961位堿基附近的異質(zhì)性的缺失，插入突變以及該基因中兩個(gè)同質(zhì)性的突變，可導(dǎo)致產(chǎn)生氨基糖苷類(lèi)藥物耳毒易感性。但近年來(lái)有研究并不支持mtDNA961delT/insC突變是氨基糖苷類(lèi)抗生素誘發(fā)性耳聾的遺傳基礎(chǔ)[12-13]。李建忠等[14]認(rèn)為mtDNA 961位點(diǎn)附近可能是一個(gè)多變異的區(qū)域，mtDNA 961delT/insC可能是一個(gè)與氨基甙類(lèi)藥物性耳聾不明確相關(guān)的多態(tài)。同時(shí)也有研究表明mtDNA G1007A和A1313G點(diǎn)突變、mtDNA G7444A突變可能分別參與了A1555G導(dǎo)致的聽(tīng)力損害的過(guò)程[15]。Li等[16]報(bào)道線粒體12SrRNA基因的A827G，T1005C和A1116G突變可能參與AAID的發(fā)病機(jī)制。

根據(jù)本研究數(shù)據(jù)提示，與MT-RNR1基因上的961delT/insC、A1555G、C1494T一樣，T1005C、T1107C突變或許也是一個(gè)在中國(guó)人群中常見(jiàn)的藥物敏感致聾靶點(diǎn)，尤其是在新疆的少數(shù)民族聚集地區(qū)。對(duì)于部分突變頻率低的位點(diǎn)，我們希望日后能展開(kāi)更多更詳盡的研究。本研究將有助于更進(jìn)一步揭示氨基糖苷類(lèi)藥物中毒性耳聾的病因，以及臨床表現(xiàn)的遺傳基礎(chǔ)和本質(zhì)，是實(shí)現(xiàn)臨床大規(guī)?；蛟\斷的基礎(chǔ)，對(duì)于耳聾基因的個(gè)體治療也有著重要意義。

參考文獻(xiàn)

[1]楊?lèi)?ài)芬.浙江省非綜合征型聾病分子流行病學(xué)調(diào)查[C]. 溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文, 2008.

[2]鄧萬(wàn)俊.氨基糖苷類(lèi)藥物臨床應(yīng)用再評(píng)價(jià)[J].國(guó)外醫(yī)藥抗生素分冊(cè), 2010,3l(5): 219-223.

[3]Li Z, Li R, Chen J,etal. Mutational analysis of the mitochondrial 12SrRNA gene in Chinese pediatric subjects with aminoglycoside-induced and non-syndromic hearing loss[J].HumGenet, 2005, 117(1): 9-15.

[4]Guan M X.Mitochondrial 12SrRNA mutations associated with aminoglycoside ototoxicity[J].Mitochondrion, 2011, 11(2): 237-245.

[5]張 婷, 曾愛(ài)平, 鄭 靜,等.與耳聾相關(guān)的線粒體12SrRNA突變[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2012, 28(4):316-325.

[6]Tessa A, Giannotti A, Tieri L,etal. Maternally inherited deafness associated with a T1095C mutation in the mDNA[J].EurJHumGenet, 2002, 9(2): 147-149.

[7]劉 新, 戴 樸, 黃德亮,等. 線粒體DNA A1555G突變大規(guī)模篩查及其預(yù)防意義探討[J].中華醫(yī)學(xué)雜志, 2006, 86(19): 1318-1322.

[8]鮑曉林, 郭玉芬, 劉曉雯,等.西北地區(qū)與東北地區(qū)耳聾先證者線粒體DNA12SrRNA A1555G突變特點(diǎn)分析[J].聽(tīng)力學(xué)及言語(yǔ)疾病雜志, 2010,18(4): 387-388.

[9]龔莎莎. 線粒體DNAC1494T突變分子流行病學(xué)調(diào)查及線粒體tRNA與耳聾關(guān)系的研究[C]. 溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文, 2011.

[10]Guan M X, Fischel-Ghodsian N, Attardi G. Biochemical evidence for nuclear gene involvement in phenotype of non-syndromic deafness associated with mitochondrial 12S rRNA mutation[J].HumMolGenet, 1996, 5(7):963-971.

[11]Bacino C, Prezant T R, Bu X, Foumier P,etal. Susceptibility mutations in the mitochondrial small ribosomal RNA gene in aminoglycoside induced deafness[J].Pharmacogenetics, 1995,5(3): 165-172．

[12]Kobayashi K, Oquci T, Asamura K,etal. Genetic features, clinical phenotypes, and prevalence of sensorineural hearing loss associated with the 961delT mitochondrial mutation[J].AurisNasusLarynx, 2005, 32(2): 119-124.

[13]Bae J W, Lee K Y, Choi S Y,etal. Molecular analysis of mitochondrial gene mutations in Korean patients with nonsyndromic hearing loss[J].IntJMolMed, 2008, 22(2): 175-180.

[14]李建忠,程 靜, 盧 宇,等.遺傳性耳聾家系線粒體DNA 961delT/insC突變的致病性分析[J]. 中華耳科學(xué)雜志, 2010,8(1): 9-13.

[15]吳超群.氨基糖苷類(lèi)抗生素致聾的遺傳易感性[J].中國(guó)優(yōu)生優(yōu)育, 2008, 14(1): 7-11.

[16]Li Z, Li R, Chen J,etal.Mutational analysis of the mitochondrial 12S rRNA gene in Chinese pediatric subjects with aminoglycoside-induced and non-syndromic hearing loss[J].HumGenet, 2005, 117(1): 9-15.