豬瘟病毒檢測(cè)方法研究進(jìn)展

王相森

（山東省高密市經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)區(qū)畜牧獸醫(yī)站山東濰坊 261500）

豬瘟病毒屬于黃病毒科瘟病毒屬成員，病毒基因組為單股正鏈RNA，近年來(lái)隨著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展，豬瘟的發(fā)病趨勢(shì)呈現(xiàn)出了明顯的變化，豬瘟發(fā)病后的臨床表現(xiàn)往往不典型，出現(xiàn)了所謂的非典型豬瘟、溫和型豬瘟等，僅通過(guò)臨床特征很難進(jìn)行確切診斷。本文主要綜述了豬瘟病毒的幾種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，為提高我國(guó)豬瘟病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷提供參考。

1 RT-PCR 檢測(cè)方法

RT-PCR 檢測(cè)方法是豬瘟病毒的常用檢測(cè)方法，該方法特異性強(qiáng)，敏感性高，檢測(cè)結(jié)果快速準(zhǔn)確[1]。豬瘟病毒基因組全長(zhǎng)12.5kb，含有一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框，5'端有一個(gè)非編碼區(qū)（5'UTR），3'端有一個(gè)非編碼區(qū)（3'UTR），通常根據(jù)豬瘟病毒5'端保守區(qū)序列設(shè)計(jì)通用型檢測(cè)引物，根據(jù)變異性較強(qiáng)的E2 基因序列設(shè)計(jì)毒株分型鑒別檢測(cè)方法。普通的RT-PCR 檢測(cè)方法根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法的不同又分為單重RT-PCR 方法和多重RT-PCR，單重RT-PCR 方法可以分為兩步RT-PCR 方法、一步法RT-PCR 方法和巢式RT-PCR 方法，兩步RT-PCR 方法的反轉(zhuǎn)錄和PCR 擴(kuò)增分步進(jìn)行，一步RT-PCR 方法是利用一步法酶在一個(gè)體系內(nèi)先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄再進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，大大簡(jiǎn)化了試驗(yàn)流程，縮短了試驗(yàn)時(shí)間，巢式RT-PCR 方法通過(guò)兩輪PCR 擴(kuò)增增加了試驗(yàn)的靈敏性，多重RT-PCR 方法是同時(shí)進(jìn)行多種病原的PCR 檢測(cè)，由于臨床病料的混合感染情況較嚴(yán)重，通過(guò)多重RT-PCR 同時(shí)實(shí)現(xiàn)多種病原的同時(shí)檢測(cè)，節(jié)約了試劑和試驗(yàn)時(shí)間，在臨床病料檢測(cè)中可以根據(jù)需要選擇適合的檢測(cè)方法。

2 RT-LAMP 檢測(cè)方法

RT-LAMP 檢測(cè)方法是核酸的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，該方法敏感、特異、方便、快捷，適用于基層實(shí)驗(yàn)室豬瘟病毒的檢測(cè)。王韋華[2]等建立了豬瘟病毒RT-LAMP 檢測(cè)方法，根據(jù)GenBank 上不同豬瘟分離株的基因組序列設(shè)計(jì)豬瘟病毒擴(kuò)增引物，通過(guò)優(yōu)化RT-LAMP檢測(cè)條件，建立了豬瘟病毒RT-LAMP 檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限量為1.0×10-7 ng/μ L，比普通RT-PCR 方法的敏感性高100 倍，為豬瘟病毒的現(xiàn)場(chǎng)快速診斷提供了方便。楊平東[3]等建立了豬瘟病毒NASBA-RT-LAMP 快速檢測(cè)方法，該方法是利用核酸序列依賴(lài)性擴(kuò)增技術(shù)（NASBA）大量擴(kuò)增病毒RNA，在進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP），該方法是將NASBA 技術(shù)和RT-LAMP 技術(shù)相結(jié)合的兩步法檢測(cè)方法，大大提高了病毒RNA 檢測(cè)的靈敏度，最低可以檢測(cè)出46 pg/μL 的病毒RNA，為豬瘟病毒的臨床檢測(cè)提供了新思路。

3 IPMA 檢測(cè)方法

IPMA 檢測(cè)方法全稱(chēng)為免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)，是在感染病毒的單層細(xì)胞上面加上一抗，再加上標(biāo)有辣根過(guò)氧化物酶的二抗，最后加上酶底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，通過(guò)抗原抗體的相互作用，產(chǎn)生特異性的顯色反應(yīng)，通過(guò)光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀(guān)察并判斷結(jié)果。張振倉(cāng)[4]等建立了豬瘟病毒的IPMA 檢測(cè)方法，最佳病毒接種量為0.5 個(gè)TCID50，一抗1:300 稀釋?zhuān)?:2000 稀釋?zhuān)瑱z測(cè)方法有很好的特異性，與其他豬病毒沒(méi)有交叉反應(yīng)，在300 份臨床樣品的檢測(cè)中，通過(guò)與RT-PCR 方法和ELISA 方法的比較，符合率在92%以上，說(shuō)明該就檢測(cè)方法有很好的特異性，敏感性，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為豬瘟病毒的臨床檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)方法

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)方法是近些年發(fā)展起來(lái)的病毒核酸低含量快速檢測(cè)技術(shù)，操作方便，檢測(cè)結(jié)果直觀(guān)，檢測(cè)時(shí)間短。張永英[5]等建立了豬瘟病毒強(qiáng)毒株SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，該方法根據(jù)豬瘟病毒強(qiáng)毒株5'UTR 區(qū)域設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物，可以快速檢測(cè)豬瘟病毒強(qiáng)毒株，最低檢出量為10 拷貝/μL，檢測(cè)結(jié)果快速準(zhǔn)確，與豬瘟弱毒、偽狂犬病毒、藍(lán)耳病病毒、豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒沒(méi)有交叉反應(yīng)，可以用于豬瘟病毒強(qiáng)毒感染的早期診斷和豬瘟的有效防控。

5 結(jié)語(yǔ)

豬瘟是一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，危害巨大，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，豬瘟病毒時(shí)刻發(fā)生變異，各種新流行毒株不斷出現(xiàn)，臨床癥狀往往不典型，大大增加了疾病診斷難度，加強(qiáng)豬瘟病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)對(duì)防控豬瘟擴(kuò)散傳播起到關(guān)鍵作用，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，各種新技術(shù)，新方法不斷應(yīng)用到豬瘟的臨床檢測(cè)中，大大提高了檢測(cè)的特異性和敏感性，為豬瘟病毒的綜合防控和早期診斷帶來(lái)方便和快捷，各種檢測(cè)方法也可以用于豬場(chǎng)豬瘟病毒的凈化，通過(guò)開(kāi)展分子流行病學(xué)調(diào)查，及時(shí)淘汰帶毒豬和隱性感染豬，為規(guī)模豬場(chǎng)的健康發(fā)展保駕護(hù)航。