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    快速檢測(cè)梅花鹿黏膜病病毒的免疫膠體金試紙條研究

    2020-11-27 21:43:09崔鶴馨田來明李男田鑫付曉霞
    中國動(dòng)物保健 2020年8期
    關(guān)鍵詞:檢測(cè)線膠體金紙條

    崔鶴馨,田來明,李男,田鑫,付曉霞

    (長春市農(nóng)業(yè)科學(xué)院長春 130111)

    鹿黏膜?。―MD)是由黏膜病病毒(MDV)引起的幼鹿嚴(yán)重腹瀉、母鹿繁殖性障礙的疾病,不利于幼鹿的良性發(fā)育,降低成鹿的生育能力,嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致鹿大量病死。既往有研究證實(shí)[1],MDV 是導(dǎo)致牛發(fā)病的主要病原之一,也能造成羊、鹿等很多反芻動(dòng)物染病。當(dāng)下國內(nèi)很多地區(qū)的鹿群養(yǎng)殖階段有程度不一的MDV 感染情況,一經(jīng)感染,病原長時(shí)間無法清除,以致養(yǎng)鹿行業(yè)承受較重?fù)p失,不利于行業(yè)可持續(xù)的發(fā)展進(jìn)程,故而應(yīng)予以DMD 一定重視,加大快速檢測(cè)診斷方法的研究力度。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1)試劑與耗材:膠體金試紙條材料套裝、氯金酸;

    2)儀器:攪拌器、電子天平、干燥箱、高壓鍋以及電鏡等;

    3)主要試劑類型:10%HAuCl4溶液、10%NaCl 溶液以及碳酸鉀0.2mol/L 等。把以上試劑整合至容積為10mL 的離心管內(nèi),充分?jǐn)嚢韬笥谜麴s水定容到10mL,低溫(-20℃)條件下保存以備用。再把以上制備的試劑加進(jìn)500mL 燒杯中,加熱攪拌至完全溶解,自然冷卻后,將其pH 調(diào)節(jié)到8.3,定容到500mL。

    1.2 方法

    首先,制備20nm 膠體金溶液。提取兩個(gè)整體硅化的200mL 三角燒瓶,依次兌入50mL 四蒸水溶液,安置在攪拌器上加熱處理到沸騰。而后依次加入100μL 的10%的氯金酸、2.5mL 檸檬酸鈉溶液,使溶液最后顏色穩(wěn)定在酒紅色。針對(duì)制備好的膠體金溶液予以冷卻處理后,用0.21μm 予以過濾處理,借助透射電鏡觀測(cè)膠體金顆粒狀態(tài)。

    其次,依照常規(guī)方法組裝膠體試紙條。即在滴加品滴加后,溶液會(huì)自行朝向吸水板方向流動(dòng),于金標(biāo)墊位置,BVD/MDV 會(huì)和膠體金探針相整合,溶液持續(xù)朝向前方流動(dòng),與BVD/MDV 相結(jié)合的金標(biāo)抗體于檢測(cè)線位置會(huì)結(jié)合一種抗BVD/MDV 的單抗(1B11),此時(shí)檢測(cè)線上就會(huì)形成膠體金溶液匯聚情況,進(jìn)而呈現(xiàn)出相應(yīng)顏色。

    再者,確定試紙條的檢測(cè)線和質(zhì)控線的最適宜濃度。本次試驗(yàn)結(jié)果表明,IgG、1F11 株單抗對(duì)應(yīng)的濃度依次是1 和1.5mg/mL,且被包裹在試紙條內(nèi)時(shí),測(cè)線和質(zhì)控線形態(tài)優(yōu)良,色澤適中。

    最后,采用免疫膠體金試紙條檢測(cè)DMD。在遼寧省某鹿場(chǎng)養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)收集30 份鹿糞等設(shè)為樣本,編號(hào)為1~30,各樣品均取用適量鹿糞,兌入適量PBS 溶液以使其呈懸浮狀態(tài),量取180μL 溶液滴加到試紙條附帶的樣品墊上進(jìn)行檢測(cè)。針對(duì)樣品內(nèi)剩余溶液,取用適量,trizol 法捕獲RNA 并合成cDNA,用BVD/MDV 特異性引物PCR 擴(kuò)增。膠體金檢測(cè)與PCR 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)階段均設(shè)置1 份陽性與陰性對(duì)照。

    2 結(jié)果

    2.1 膠體金溶液制備

    溶液呈酒紅色,清澈透亮。透射電鏡檢查階段測(cè)得金顆粒大小約為20nm,均勻分布。

    2.2 免疫膠體金試紙條檢測(cè)DMD

    PCR 擴(kuò)增結(jié)果提示,陽性檢出樣品8 份(26.7%),陰性為22 份(73.3%)。膠體金試紙條檢測(cè)結(jié)果和PCR 檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)一。

    3 討論

    現(xiàn)階段,國家相關(guān)部門已頒發(fā)了DMD/MDV 的防控計(jì)劃,并在畜群層面上取得一定成效,很多防控措施是多維性的,單純依靠疫苗接種等單一方面通常無法取而預(yù)期成效。為有效防控DMD/MDV,制定周全策略,最先做的工作便是了解病毒有關(guān)臨床表現(xiàn)及對(duì)畜牧業(yè)形成的影響。若想要從一個(gè)畜群內(nèi)徹底清除DMD/MDV 的目標(biāo)范疇,需突破的難點(diǎn)是防控病毒侵入為感染DMD/MDV 的牲畜,為達(dá)成以上目標(biāo),通常會(huì)采用多樣化的診斷檢測(cè)、疫苗免疫及生物安全計(jì)劃等措施。故而應(yīng)從了解畜群DMD/MDV 感染狀況、現(xiàn)行管理辦法及后續(xù)階段可能新引進(jìn)的措施等方面做出判斷。

    膠體金顆粒內(nèi)徑大小影響抗體標(biāo)記及后期試紙條檢測(cè)環(huán)節(jié)的精確度、敏感性。既往有報(bào)道指出,伴隨膠體金顆粒內(nèi)徑的擴(kuò)增過程,膠體金探針在溶液內(nèi)的安穩(wěn)性有跌落趨勢(shì);但內(nèi)徑過小,也不利于維持金顆粒的均勻性、分散度,也會(huì)降低試紙條的穩(wěn)定性。故而,在制取膠體試紙條階段,推薦把顆粒調(diào)控為20nm,通常能取得較優(yōu)良的檢測(cè)結(jié)果。

    本次試驗(yàn)研究階段,選用檸檬酸三鈉還原法制取了20nm 膠體金溶液,電鏡檢查提示顆粒呈圓形,直徑基本上均是20nm 左右,均勻分布,提示成功制取了膠體金溶液。選擇疑似MDV 感染的30 份臨床樣品加以檢測(cè),結(jié)果提示試紙條與PCR 陽性檢出率一致,均為26.7%。并且經(jīng)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),本試驗(yàn)研究階段制備的試紙條特異性優(yōu)良。最低能檢測(cè)出103TCID50/mL 的病毒濃度,在MDV 感染檢測(cè)領(lǐng)域中有一定推廣價(jià)值。█

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