一株鴨源巴氏桿菌的分離及莢膜抗原血清型鑒定

賈仰波

(山東省博興縣畜牧獸醫(yī)局山東濱州 256500)

鴨巴氏桿菌病又稱鴨霍亂，是由禽多殺性巴氏桿菌引起的一種急性、敗血性、高度接觸性傳染病，該病主要引起禽類出血性敗血癥，發(fā)病急、死亡快。多殺性巴氏桿菌根據(jù)莢膜抗原可以分為A、B、D、E、F 等5 種血清型，且不同血清型之間缺乏有效的交叉免疫保護(hù)力，通常我國(guó)家禽中主要流行A 型多殺性巴氏桿菌。2018 年5 月某鴨場(chǎng)270 日齡的產(chǎn)蛋鴨突然出現(xiàn)大規(guī)模死亡情況，未死病鴨多精神沉郁、呼吸困難、食欲廢絕、排黃綠色稀糞，急性病死鴨沒有明顯的臨床癥狀，發(fā)病率約21%，死亡率高達(dá)40%。對(duì)病死鴨進(jìn)行剖檢有明顯的敗血癥癥狀，肝臟腫大、質(zhì)脆，表面有大量針尖大小的灰白色壞死點(diǎn)，心包膜增厚、有積液，各段腸黏膜彌漫性出血，脾臟腫大出血等。本文從這例典型的鴨巴氏桿菌病中分離一株鴨源莢膜血清型為A 型的巴氏桿菌并對(duì)其進(jìn)行鑒定，可為臨床診斷和治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源病死鴨來自山東某鴨場(chǎng)，無菌采集心臟、肝臟作為病料。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑培養(yǎng)基胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、新生牛血清等，均購自武漢潔洋盛科技有限公司；革蘭氏染色試劑，購自北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；藥敏紙片和微量生化試管，購自杭州微生物試劑有限公司；2×Taq PCR Mix、DL2000 DNA Marker 均購自上海生工生物工程有限公司。

1.1.3 PCR 引物根據(jù)禽多殺性巴氏桿菌特異基因設(shè)計(jì)PCR 引物。鑒定引物序列如下，P1：5'-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3'，P2:5'-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3'，目的片段為457bp；莢膜血清型A、B、D、E、F 特異性基因引物序列如下，A1：5'-TGCCAAAATCGCAGTCAG-3'，A2：5'-TTGCCATCATTGTCAGTG-3'，目的片段為1044bp；B1：5'-CATTTATCCAAGCTCCACC-3'，B2：5'-GCCCGAGAGTTTCAATCC-3'，目的片段為760bp；D1：5'-TTACAAAAGAAAGACTAGGAGCCC-3'，D2：5'-CATCTACCCACTCAACCATATCAG-3'，目的片段為657bp；E1：5'-TCCGCAGAAAATTATTGACTC-3'，E2：5'-GCTTGCTCTTGATTTTG TC-3'，目的片段為 511bp；F1：5'-AATCGGAGAACGCAGAAATCAG-3'，F(xiàn)2：5'-TTCCGCCGTCAATTACTCTG-3'，目的片段為851bp。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離無菌環(huán)境下將采集的心臟、肝臟等病料接種到2%新生牛血清胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫培養(yǎng)24h，觀察菌落形態(tài)，挑取典型單菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，同時(shí)劃線接種于含2%新生牛血清TSA 平板純化培養(yǎng)。

1.2.2 生化試驗(yàn)按常規(guī)方法進(jìn)行生化試驗(yàn)，將純化的病原菌分別接種于各微量生化發(fā)酵管內(nèi)，37℃培養(yǎng)24～48h，觀察反應(yīng)結(jié)果。

1.2.3 PCR 鑒定 將純化分離菌煮沸10min，10,000rpm 離心5min，取上清液作為PCR 模板；鑒定PCR 體系為：2× Taq PCR Mix 10μL、上下游引物各0.5μL、模板1μL，補(bǔ)ddH2O 至20μL，同時(shí)設(shè)立陰陽性對(duì)照，陽性對(duì)照選用標(biāo)準(zhǔn)株C48-2 株（CVCC44802）；反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min，95℃變性40s，55℃退火40s，72℃延伸40s，30 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min；分型使用多重PCR 方法，反應(yīng)體系和條件與鑒定PCR 一致。PCR 反應(yīng)結(jié)束后用1%的瓊脂糖凝膠板電泳，并用凝膠成像儀進(jìn)行成像分析。

1.2.4 藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散（K-B）法進(jìn)行分離菌的藥敏試驗(yàn)。選用15 種藥敏紙片：大觀霉素、諾氟沙星、頭孢曲松、四環(huán)素、阿米卡星、阿奇霉素、新霉素、林可霉素、克林霉素、鏈霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、多黏菌素B、磺胺異噁唑、多西環(huán)素，37℃培養(yǎng)24h后觀察測(cè)量抑菌圈的直徑，按照抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)（CLSI）進(jìn)行敏感性分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離

在2%新生牛血清胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上可見有圓形、灰白色、邊緣整齊、濕潤(rùn)似露珠樣的大小不一菌落，革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性短桿菌；而在麥康凱平板上無菌生長(zhǎng)。

2.2 生化試驗(yàn)

生化鑒定結(jié)果顯示該分離株能夠發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、半乳糖、果糖、甘露醇，不發(fā)酵麥芽糖、乳糖、棉子糖、鼠李糖，脲酶試驗(yàn)、甲基紅和V-P 試驗(yàn)陰性，接觸酶試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)為陽性，與多殺性巴氏桿菌的生化特征相似。

2.3 PCR 鑒定

鑒定PCR 產(chǎn)物在457bp 處得到預(yù)期的目的條帶。A、B、D、E、F 莢膜血清型分型PCR 檢測(cè)只擴(kuò)增出了大小約1000bp 的目的條帶，與莢膜血清A 型特異性基因預(yù)期大小一致。由此根據(jù)臨床癥狀、剖檢變化、菌株的形態(tài)特征、生化特性及PCR 鑒定分型結(jié)果，確定該分離株為鴨源莢膜血清A 型多殺性巴氏桿菌。

2.4 藥敏試驗(yàn)

藥敏結(jié)果表明該分離菌呈多重耐藥，對(duì)大觀霉素、多黏菌素B中度敏感，對(duì)頭孢曲松低敏，對(duì)諾氟沙星、四環(huán)素、阿米卡星、阿奇霉素、新霉素、林可霉素、克林霉素、鏈霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、磺胺異噁唑、多西環(huán)素耐藥。

3 討論

鴨巴氏桿菌病是當(dāng)前嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的重要細(xì)菌性傳染病之一，急性型發(fā)病率和死亡率可高達(dá)80%～90%，尤其產(chǎn)蛋鴨更易感染發(fā)病。經(jīng)了解該養(yǎng)殖場(chǎng)沒有及時(shí)免疫接種巴氏桿菌疫苗，加之發(fā)病前期氣候突然變化等應(yīng)激因素影響，導(dǎo)致了此次鴨巴氏桿菌病的發(fā)生。加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，正確免疫仍是控制鴨巴氏桿菌病的主要措施，利用禽巴氏桿菌病蜂膠滅活疫苗可以起到很好的預(yù)防效果?！?/p>