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    一株鴨源巴氏桿菌的分離及莢膜抗原血清型鑒定

    2020-11-27 13:34:48賈仰波
    中國動(dòng)物保健 2020年2期

    賈仰波

    (山東省博興縣畜牧獸醫(yī)局山東濱州 256500)

    鴨巴氏桿菌病又稱鴨霍亂,是由禽多殺性巴氏桿菌引起的一種急性、敗血性、高度接觸性傳染病,該病主要引起禽類出血性敗血癥,發(fā)病急、死亡快。多殺性巴氏桿菌根據(jù)莢膜抗原可以分為A、B、D、E、F 等5 種血清型,且不同血清型之間缺乏有效的交叉免疫保護(hù)力,通常我國家禽中主要流行A 型多殺性巴氏桿菌。2018 年5 月某鴨場270 日齡的產(chǎn)蛋鴨突然出現(xiàn)大規(guī)模死亡情況,未死病鴨多精神沉郁、呼吸困難、食欲廢絕、排黃綠色稀糞,急性病死鴨沒有明顯的臨床癥狀,發(fā)病率約21%,死亡率高達(dá)40%。對(duì)病死鴨進(jìn)行剖檢有明顯的敗血癥癥狀,肝臟腫大、質(zhì)脆,表面有大量針尖大小的灰白色壞死點(diǎn),心包膜增厚、有積液,各段腸黏膜彌漫性出血,脾臟腫大出血等。本文從這例典型的鴨巴氏桿菌病中分離一株鴨源莢膜血清型為A 型的巴氏桿菌并對(duì)其進(jìn)行鑒定,可為臨床診斷和治療提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 病料來源病死鴨來自山東某鴨場,無菌采集心臟、肝臟作為病料。

    1.1.2 培養(yǎng)基及試劑培養(yǎng)基胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、新生牛血清等,均購自武漢潔洋盛科技有限公司;革蘭氏染色試劑,購自北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品;藥敏紙片和微量生化試管,購自杭州微生物試劑有限公司;2×Taq PCR Mix、DL2000 DNA Marker 均購自上海生工生物工程有限公司。

    1.1.3 PCR 引物根據(jù)禽多殺性巴氏桿菌特異基因設(shè)計(jì)PCR 引物。鑒定引物序列如下,P1:5'-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3',P2:5'-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3',目的片段為457bp;莢膜血清型A、B、D、E、F 特異性基因引物序列如下,A1:5'-TGCCAAAATCGCAGTCAG-3',A2:5'-TTGCCATCATTGTCAGTG-3',目的片段為1044bp;B1:5'-CATTTATCCAAGCTCCACC-3',B2:5'-GCCCGAGAGTTTCAATCC-3',目的片段為760bp;D1:5'-TTACAAAAGAAAGACTAGGAGCCC-3',D2:5'-CATCTACCCACTCAACCATATCAG-3',目的片段為657bp;E1:5'-TCCGCAGAAAATTATTGACTC-3',E2:5'-GCTTGCTCTTGATTTTG TC-3',目的片段為 511bp;F1:5'-AATCGGAGAACGCAGAAATCAG-3',F(xiàn)2:5'-TTCCGCCGTCAATTACTCTG-3',目的片段為851bp。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)菌分離無菌環(huán)境下將采集的心臟、肝臟等病料接種到2%新生牛血清胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上,37℃恒溫培養(yǎng)24h,觀察菌落形態(tài),挑取典型單菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢,同時(shí)劃線接種于含2%新生牛血清TSA 平板純化培養(yǎng)。

    1.2.2 生化試驗(yàn)按常規(guī)方法進(jìn)行生化試驗(yàn),將純化的病原菌分別接種于各微量生化發(fā)酵管內(nèi),37℃培養(yǎng)24~48h,觀察反應(yīng)結(jié)果。

    1.2.3 PCR 鑒定 將純化分離菌煮沸10min,10,000rpm 離心5min,取上清液作為PCR 模板;鑒定PCR 體系為:2× Taq PCR Mix 10μL、上下游引物各0.5μL、模板1μL,補(bǔ)ddH2O 至20μL,同時(shí)設(shè)立陰陽性對(duì)照,陽性對(duì)照選用標(biāo)準(zhǔn)株C48-2 株(CVCC44802);反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min,95℃變性40s,55℃退火40s,72℃延伸40s,30 個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min;分型使用多重PCR 方法,反應(yīng)體系和條件與鑒定PCR 一致。PCR 反應(yīng)結(jié)束后用1%的瓊脂糖凝膠板電泳,并用凝膠成像儀進(jìn)行成像分析。

    1.2.4 藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散(K-B)法進(jìn)行分離菌的藥敏試驗(yàn)。選用15 種藥敏紙片:大觀霉素、諾氟沙星、頭孢曲松、四環(huán)素、阿米卡星、阿奇霉素、新霉素、林可霉素、克林霉素、鏈霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、多黏菌素B、磺胺異噁唑、多西環(huán)素,37℃培養(yǎng)24h后觀察測量抑菌圈的直徑,按照抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(CLSI)進(jìn)行敏感性分析。

    2 結(jié)果

    2.1 細(xì)菌分離

    在2%新生牛血清胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上可見有圓形、灰白色、邊緣整齊、濕潤似露珠樣的大小不一菌落,革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性短桿菌;而在麥康凱平板上無菌生長。

    2.2 生化試驗(yàn)

    生化鑒定結(jié)果顯示該分離株能夠發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、半乳糖、果糖、甘露醇,不發(fā)酵麥芽糖、乳糖、棉子糖、鼠李糖,脲酶試驗(yàn)、甲基紅和V-P 試驗(yàn)陰性,接觸酶試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)為陽性,與多殺性巴氏桿菌的生化特征相似。

    2.3 PCR 鑒定

    鑒定PCR 產(chǎn)物在457bp 處得到預(yù)期的目的條帶。A、B、D、E、F 莢膜血清型分型PCR 檢測只擴(kuò)增出了大小約1000bp 的目的條帶,與莢膜血清A 型特異性基因預(yù)期大小一致。由此根據(jù)臨床癥狀、剖檢變化、菌株的形態(tài)特征、生化特性及PCR 鑒定分型結(jié)果,確定該分離株為鴨源莢膜血清A 型多殺性巴氏桿菌。

    2.4 藥敏試驗(yàn)

    藥敏結(jié)果表明該分離菌呈多重耐藥,對(duì)大觀霉素、多黏菌素B中度敏感,對(duì)頭孢曲松低敏,對(duì)諾氟沙星、四環(huán)素、阿米卡星、阿奇霉素、新霉素、林可霉素、克林霉素、鏈霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、磺胺異噁唑、多西環(huán)素耐藥。

    3 討論

    鴨巴氏桿菌病是當(dāng)前嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的重要細(xì)菌性傳染病之一,急性型發(fā)病率和死亡率可高達(dá)80%~90%,尤其產(chǎn)蛋鴨更易感染發(fā)病。經(jīng)了解該養(yǎng)殖場沒有及時(shí)免疫接種巴氏桿菌疫苗,加之發(fā)病前期氣候突然變化等應(yīng)激因素影響,導(dǎo)致了此次鴨巴氏桿菌病的發(fā)生。加強(qiáng)飼養(yǎng)管理,正確免疫仍是控制鴨巴氏桿菌病的主要措施,利用禽巴氏桿菌病蜂膠滅活疫苗可以起到很好的預(yù)防效果?!?/p>

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