有限采樣法估算腎病患兒口服咪唑立賓藥時曲線下面積模型的建立與驗(yàn)證

薛 源，趙宇蕾，齊謝敏，朱婷婷，黃曉暉，芮建中，周國華

0 引 言

咪唑立賓(Mizoribine，MZR)是由日本學(xué)者旭化成從土壤中分離的子囊菌M-2166株培養(yǎng)濾液中分離出來的一種咪唑類核苷，通過競爭性地抑制嘌呤合成系統(tǒng)中的次黃嘌呤核苷酸至鳥苷酸途徑從而抑制核酸合成，最終發(fā)揮免疫抑制作用[1]。腎病綜合征是一種兒童常見且具有挑戰(zhàn)性的慢性腎病，其中頻復(fù)發(fā)型腎病患兒占比約46%～51%[2]，MZR聯(lián)合足量激素治療頻復(fù)發(fā)型腎病患兒可減少復(fù)發(fā)和降低糖皮質(zhì)激素用量，提高臨床緩解率[3]。MZR口服易吸收，主要以原形從腎排泄，主要不良反應(yīng)為高尿酸血癥，與霉酚酸和硫唑嘌呤相比骨髓抑制作用較輕,也可導(dǎo)致血小板或紅細(xì)胞數(shù)量降低[4]。通過前期的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MZR的血清藥物濃度存在較大的個體差異，Ishida等[5]的研究表明，口服生物利用度(F)的個體差異是MZR藥代動力學(xué)變異的主要原因之一。

已有研究證明，MZR的有效性與血清藥物濃度存在相關(guān)性[6]。Xia等[7]的研究認(rèn)為MZR的藥效與血清藥物濃度及藥時曲線下面積(AUC)均存在較高相關(guān)性。AUC能夠體現(xiàn)體內(nèi)藥物的暴露水平，是研究藥代動力學(xué)及藥效學(xué)的重要指標(biāo)。使用傳統(tǒng)方法計算AUC存在其局限性，由于需要多點(diǎn)采集血樣，患者依從性差，研究成本過高，不適合在臨床使用。本文使用腎病患兒口服MZR后體內(nèi)血清藥物濃度數(shù)據(jù)，以有限采樣法(limited sampling strategy, LSS)通過較少血清藥物濃度(1或2個)建立數(shù)學(xué)模型，對MZR的AUC0-t進(jìn)行估算，同時以內(nèi)部數(shù)據(jù)通過JackKnife法進(jìn)行模型驗(yàn)證，并使用S形最大效應(yīng)(Emax)模型考察MZR有效性與AUC0-t的相關(guān)性。通過有限的單點(diǎn)或兩點(diǎn)血清樣本采集，估算患兒個體AUC0-t，并預(yù)測MZR臨床有效性，為臨床個體化給藥提供數(shù)據(jù)參考。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)(G1322A在線脫氣機(jī)，G1311A泵，G1314A紫外檢測器，Agilent ChemStation化學(xué)工作站)；電子分析天平(XS205DU，Mettler Toledo)；pH計(PHS-3C型，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)。MZR對照品(純度>99%，日本旭化成公司，批號：BDNA-1378)；磷酸二氫鉀、十二水合磷酸氫二鈉(市售，藥用級)；甲醇(色譜純)；其他試劑為分析純；試驗(yàn)用水為市售純凈水。

1.2 色譜條件色譜柱：Megres C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-40 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(pH=3.5，2∶98，v/v)；檢測波長：280 nm；柱溫室溫(25 ℃)；流速：0.9 mL/min；進(jìn)樣體積：20 μL。

1.3 血樣采集與處理收集18例腎病綜合征患兒(其中男14例，女4例)血液樣本(服用咪唑立賓片75～300 mg)，每例患者均包括服藥前(0 h)以及服藥后2、3、4、6、8、12 h的7份樣本，收集于采血管中。離心分離血清，取上層血清樣品200 μL于離心管中，加入6% 高氯酸100 μL，旋渦混合15 s，13 000 r/min(離心半徑為30 mm)離心10 min后，取上清液檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析① 數(shù)據(jù)分析程序：IBM SPSS Statistics(Version 20.0, IBM Corp, USA), SAS 9.1 for windows (SAS institute inc. Cary , NC27513, USA), Phoenix 64(Version 8.1,Pharsight Corp, USA)。② 缺失數(shù)據(jù)補(bǔ)充：本研究收集了18例次患兒(其中1例為重復(fù)采樣)共計，103個血清樣本。采用Phoenix WinNonlin 8.1進(jìn)行房室模型擬合，考察MZR在兒童患者體內(nèi)的藥代動力學(xué)模型。在一房室模型的藥代動力學(xué)中，以血清藥物濃度取對數(shù)對時間作圖，在時間較大的區(qū)段內(nèi)近似為一條直線。使用第9、11、12例樣本中3 h與6 h的血清藥物濃度建立數(shù)學(xué)方程，得到直線的斜率和截距，計算缺失的4 h數(shù)據(jù)點(diǎn)血清藥物濃度。采用Phoenix WinNonlin 8.1，計算運(yùn)行條件為64位機(jī)，使用一房室模型法擬合，補(bǔ)充剩余的缺失數(shù)據(jù)點(diǎn)。③經(jīng)典藥代動力學(xué)參數(shù)計算：采用Phoenix WinNonlin 8.1，使用非房室模型法(NCA)計算腎病患兒口服MZR后AUC0-t。④LSS模型的建立：對18例次血清藥物濃度的數(shù)據(jù)點(diǎn)用SPSS進(jìn)行多元線性回歸，采用逐步篩選策略(Stepwise forward)遴選所有采血點(diǎn)中任意單點(diǎn)或兩點(diǎn)與AUC0-t相關(guān)性較好的回歸方程，確定與AUC0-t具有顯著相關(guān)性的采樣時間點(diǎn)?；貧w方程公式：

AUC0-t=Intercept+M1×Ct1+M2×Ct2+M3×Ct3+…Mi×Cti(i≤2)

上述公式中AUC0-t為0到t的藥時曲線下面積，Intercept為截距，Mi為回歸系數(shù)，Cti為ti時間點(diǎn)MZR的血清藥物濃度。MZR半衰期較短，所有病例中只有一例測出C0，其余患兒C0均低于定量檢測下限或未檢測，12 h采血點(diǎn)與服藥時間間隔過長，臨床意義較低，且部分病例C12點(diǎn)血清藥物濃度偏低，難以檢測，所以在進(jìn)行多元回歸時，剔除C0、C12。⑤模型的驗(yàn)證：在缺少外部數(shù)據(jù)的情況下，采用JackKnife法進(jìn)行內(nèi)部模型驗(yàn)證[8]。以預(yù)測誤差(prediction error, PE%)、絕對預(yù)測誤差(absolute prediction error, APE%)、平均預(yù)測誤差(mean prediction error, MPE%)、誤差均方的平方根(root mean square prediction error, RMSE%)表示模型的準(zhǔn)確度。MPE越接近于0, RMSE越小, PE %及APE %不超過±15%的樣本數(shù)越少,擬合模型的準(zhǔn)確度越高。計算公式：

APE%=|PE%|

⑥AUC0-t與藥效相關(guān)性分析：大量蛋白尿是腎病綜合征患者主要的臨床表現(xiàn)，也是腎病綜合征最基本的病理生理機(jī)制，患者進(jìn)入緩解期后，使用試紙連續(xù)3d測得尿蛋白為3+(相當(dāng)于300mg/dL)則視為腎病綜合征復(fù)發(fā)。考察腎病患兒服用MZR 12個月后復(fù)發(fā)改善率與AUC0-t的相關(guān)性。復(fù)發(fā)改善率計算公式如下：

M為患者開始服用MZR前12個月內(nèi)腎病綜合征復(fù)發(fā)的次數(shù)，N為患者開始服用MZR后12個月內(nèi)腎病綜合征復(fù)發(fā)的次數(shù)。

S形最大效應(yīng)(Emax)模型是最常用的藥效學(xué)模型，用于藥物效應(yīng)隨濃度呈S形曲線變化時的藥效學(xué)研究，本研究采用Phoenix WinNonlin 8.1(PD模型)考察AUC0-t與復(fù)發(fā)改善率是否符合S形Emax模型。

2 結(jié) 果

2.1 MZR血藥濃度測定18例患兒(其中1例為重復(fù)采樣)口服MZR后，體內(nèi)藥代動力學(xué)特征符合一階房室模型，而不同時間點(diǎn)的血清藥物濃度均差別較大。見圖1。

圖1 口服MZR后血藥濃度-時間曲線

2.2 經(jīng)典藥動學(xué)計算結(jié)果使用Phoenix WinNonlin 8.1進(jìn)行藥動學(xué)計算時發(fā)現(xiàn)，不考慮滯后時間(Tlag)，藥時曲線精確度更高，所以本文在進(jìn)行藥代動力學(xué)計算時忽略了Tlag的影響。18例患兒主要藥代動力學(xué)參數(shù)見表1。

表 1 基于非房室模型算法的藥代動力學(xué)參數(shù)

2.3 LSS法建立多元線性回歸方程使用LSS法以給藥后第2、3、4、6、8小時的血清藥物濃度建立AUC0-t的回歸方程，結(jié)果如下：AUC0-t=4.72 C2，R2為0.41；AUC0-t=5.78 C3，R2為0.95；AUC0-t=7.23 C4，R2為0.96；AUC0-t=8.77 C6+3.12，R2為0.95；AUC0-t=14.40 C8+4.02，R2為0.91。以給藥后第3、4小時兩點(diǎn)的血清藥物濃度建立AUC0-t的回歸方程為AUC0-t=2.57 C3+4.18 C4，R2為0.98。由結(jié)果可知，給藥后第3、4、6、8小時的血清藥物濃度與AUC0-t的相關(guān)性均較好(R2>0.9)，給藥后第2小時的血清藥物濃度與AUC0-t的相關(guān)性較差，R2僅為0.41，而用于估算的血清藥物濃度點(diǎn)由單點(diǎn)提升到兩點(diǎn)后，其相關(guān)性得到進(jìn)一步提高。

2.4 JackKnife法驗(yàn)證結(jié)果對單點(diǎn)中相關(guān)性最好的C4點(diǎn)驗(yàn)證結(jié)果表明，MPE為0.02，RMSE為0.15，APE%>15%的共有4例，分別為第3、8、11、12例數(shù)據(jù)。而驗(yàn)證C3、C4兩點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MPE為0.03，RMSE為0.14，APE%>15%的為第8、11、12例數(shù)據(jù)。見表2、表3。

表 2 JackKnife法驗(yàn)證C4單點(diǎn)預(yù)測結(jié)果

表 3 JackKnife法驗(yàn)證C3、C4兩點(diǎn)預(yù)測結(jié)果

2.5AUC0-t與藥效相關(guān)性分析結(jié)果本研究建立復(fù)發(fā)改善率與AUC0-t的S形Emax模型，見圖2。由S形Emax模型得知，Emax為94.20%，EC50為5.70 μg/mL，復(fù)發(fā)改善率與AUC0-t具有較好的相關(guān)性(R2=0.89)。

以AUC0-t對患兒服藥12個月后的尿蛋白水平作圖，見圖3。隨著患兒口服MZR后AUC0-t的升高，12個月后的尿蛋白水平呈下降趨勢，提示AUC0-t的增加對患兒的臨床結(jié)局能夠起到有效的改善作用。

圖 2 復(fù)發(fā)改善率隨AUC0-t變化曲線

圖 3 口服MZR 12個月后尿蛋白隨AUC0-t變化水平

3 討 論

LSS法已經(jīng)被成功應(yīng)用于預(yù)測霉酚酸、麥考酚鈉、白消安等藥物的AUC0-t[9-11]，本文以腎病患兒為研究對象，在國內(nèi)首次通過LSS法探討單點(diǎn)或兩點(diǎn)的血清藥物濃度對服藥后AUC0-t的預(yù)測結(jié)果，及AUC0-t對MZR療效的影響，結(jié)果對臨床有一定的指導(dǎo)意義。

從口服MZR后AUC0-t曲線得知，不同時間點(diǎn)的血清藥物濃度均差別較大，提示MZR體內(nèi)藥代動力學(xué)過程存在較大的個體差異，因此通過治療藥物監(jiān)測調(diào)控MZR血藥濃度，能夠有效保證MZR治療安全性和有效性。通過對比Liu、Hisashi和Nagai的文獻(xiàn)[12-14]發(fā)現(xiàn)，兒童與成人體內(nèi)PK過程存在差異，想要獲得相同的藥物峰濃度，兒童患者需要服用更高劑量的MZR。Chen等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，服用MZR后AUC0-t和谷濃度(C0)及峰濃度(Cmax)之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.894和0.916(均P<0.001)，提示單點(diǎn)可用于評價體內(nèi)MZR的暴露量。使用LSS法建立多元回歸方程估算口服MZR后的AUC0-t，通過以每一個單點(diǎn)建立回歸方程后發(fā)現(xiàn)，C3、C4、C6、C8與AUC0-t的相關(guān)性均較好(R2>0.9)，提示C3、C4、C6、C8均可用于估算AUC0-t。Ishida等[5]使用LSS法分析得出，2個時間點(diǎn)(3 h和6 h)的血清藥物濃度對AUC0-t的估算最為準(zhǔn)確。而本研究估算2點(diǎn)與MZR的AUC0-t相關(guān)性時，得到相關(guān)性最好的兩點(diǎn)為3 h和4 h時的血清藥物濃度，從臨床實(shí)際考慮，采集3 h和4 h時的血樣具有更好的依從性。而4 h時的血清藥物濃度點(diǎn)在以單點(diǎn)及兩點(diǎn)建立回歸方程時均被選擇，可能是由于原始數(shù)據(jù)集中4 h采樣點(diǎn)有較多缺失，實(shí)際運(yùn)算時采用了一房室模型擬合的理想化數(shù)據(jù)導(dǎo)致。

使用JackKnife法驗(yàn)證單點(diǎn)與兩點(diǎn)預(yù)測AUC0-t的結(jié)果表明，C4點(diǎn)預(yù)測AUC0-t時，第3、8、11、12例數(shù)據(jù)APE%>15%(分別為20.02%、46.72%、26.94%、17.33%)，C3、C4兩點(diǎn)預(yù)測AUC0-t時，第8、11、12例數(shù)據(jù)APE%>15%(分別為33.77%、27.47%、22.94%)，預(yù)測誤差較大的數(shù)據(jù)減少且偏離程度相對降低，提示使用兩點(diǎn)預(yù)測模型后，血清藥物濃度點(diǎn)對AUC0-t預(yù)測的準(zhǔn)確性得到進(jìn)一步提高。由于臨床實(shí)際中，患兒采血依從性較差，第11、12例患兒只采集到3個血清藥物濃度點(diǎn)。而第8例患兒數(shù)據(jù)不符合一房室模型特征。為保證數(shù)據(jù)真實(shí)性與完整性，此3例數(shù)據(jù)被納入研究，使用NCA法計算時，可能使得AUC0-t觀測值與真實(shí)值產(chǎn)生較大偏差，最終導(dǎo)致模型驗(yàn)證時，APE%>15%。若剔除采樣點(diǎn)過少或不符合一房室的3例，則單點(diǎn)預(yù)測AUC0-t時，僅有1例數(shù)據(jù)APE%大于15%，而當(dāng)采用兩點(diǎn)預(yù)測AUC0-t時，APE%均小于15%。

S型Emax模型顯示AUC0-t的增加能夠減少患兒腎病綜合征復(fù)發(fā)的次數(shù)，通過對患兒12個月后的尿蛋白水平研究發(fā)現(xiàn)，隨著AUC0-t的增加，尿蛋白水平趨向于降低(圖3)，結(jié)果與S型Emax模型一致。而有研究證明，Cmax與復(fù)發(fā)改善率及尿蛋白的降低亦有較高的效應(yīng)相關(guān)，該研究建立Cmax與復(fù)發(fā)改善率的S型Emax模型得知，Emax為93.30%，EC50為1.2 μg/mL，R2為0.87，提示AUC0-t與Cmax均可以評價MZR的有效性[8]。朱婷婷等[16]的研究認(rèn)為在臨床實(shí)踐中監(jiān)測C2或C3時間點(diǎn)濃度具有臨床應(yīng)用價值。然而臨床實(shí)際中達(dá)到Cmax的時間因人而異，對比不同的研究[17-18]發(fā)現(xiàn)，Tmax分布于2 h至6 h，本研究通過NCA法得到的Tmax為(2.39±0.50)h。所以從臨床實(shí)際綜合考慮，相對于獲得不同患者的Cmax，采集患者固定單點(diǎn)或兩點(diǎn)的血藥濃度，通過LSS法估算AUC0-t，可能更易于評價MZR有效性。

本研究使用LSS法估算口服MZR后的AUC0-t，結(jié)果提示單點(diǎn)和兩點(diǎn)對AUC0-t的預(yù)測結(jié)果良好，兩點(diǎn)法預(yù)測AUC0-t更優(yōu)。從臨床實(shí)際出發(fā)，單點(diǎn)推薦C3，兩點(diǎn)推薦C3和C4。采用單點(diǎn)或兩點(diǎn)估算AUC0-t能夠減少采血點(diǎn)，提高患者依從性，同時減少檢測成本，為臨床提供便利。