金屬有機骨架材料負(fù)載酶的研究進(jìn)展及應(yīng)用

汪隆茜，喻 玨，鄭召浩，王雅文，楊孟楷

（南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210000）

酶作為一種重要的生物大分子催化劑，具有專一性、高催化活性、對環(huán)境無污染等特點，被廣泛應(yīng)用于化工、食品、制藥等行業(yè)[1-2]。但酶對極端pH 的耐受性差，穩(wěn)定性和可重復(fù)利用性較低，這些缺點阻礙了酶在工業(yè)應(yīng)用上的進(jìn)一步發(fā)展。將酶固定在載體上，可以克服上述缺點，提高酶的使用性能[3]。與游離酶相比，固定化酶提高了酶的穩(wěn)定性，增加了酶的重復(fù)使用次數(shù)，使酶更容易從溶劑中分離。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，可用于固定酶的固體載體有介孔二氧化硅[4]、碳納米管[5]、氧化石墨烯[6]、溶膠-凝膠[7]等。但是，酶與二氧化硅之間缺少特定的相互作用，會導(dǎo)致酶分子浸出，而且酶的比活度會受到介孔二氧化硅的孔徑大小的影響[8]。在溶膠-凝膠與酶固定的過程中，酶容易失活[9]。

金屬有機骨架材料（MOFs）是由金屬離子和有機配體通過配位鍵連接而成的多孔聚合材料，因具有巨大的比表面積、超高的孔隙率、優(yōu)異的熱穩(wěn)定性、可調(diào)節(jié)的孔徑、配體官能團可控等特性[10]，優(yōu)于其他固體載體。本文介紹了MOFs 固定酶的優(yōu)勢及通用方法，并總結(jié)了目前酶-MOF 復(fù)合材料的主要應(yīng)用，以期為MOFs 材料負(fù)載酶的深入研究提供理論支持。

1 MOFs 負(fù)載酶的優(yōu)勢

通常來說，可用于固定化酶的載體，除了本身需要有較高的化學(xué)穩(wěn)定性外，還應(yīng)具備能與酶分子有效結(jié)合的官能團，并可暴露出催化劑的活性位點，以便于底物分子附著。除此之外，在極端條件下，載體應(yīng)能保護酶分子不受外界環(huán)境影響，使復(fù)合物保持較高的催化活性[11]。與其他固定化酶載體相比，MOFs 因其獨特而豐富的特性，優(yōu)勢更為明顯，也因此受到人們的廣泛關(guān)注。本文總結(jié)了MOFs 負(fù)載酶的3 個優(yōu)勢：可重復(fù)性、高催化活性以及高穩(wěn)定性。

1.1 可重復(fù)性

在工業(yè)應(yīng)用中，游離酶因不能回收和重復(fù)利用，往往會增加經(jīng)濟成本，不便于大規(guī)模的生產(chǎn)使用，而固定化酶則可避免這一問題的產(chǎn)生。Pang 等[12]合成了羧基修飾的雙峰介孔Zr-MOF 材料，通過物理吸附作用固定了漆酶。固定后的漆酶在重復(fù)使用10 次后，其活性仍能達(dá)到50%，并且在水溶液里保存3 周后，仍能保持初始活性的55.4%。Tan 等[13]通過靜電相互作用，將GOx(葡萄糖氧化酶)固定在PCN-222(Fe)上。GOx/PCN-222(Fe)復(fù)合材料表現(xiàn)出良好的可循環(huán)使用性，經(jīng)6 次重復(fù)使用后，其轉(zhuǎn)化率并未發(fā)現(xiàn)有顯著降低。

1.2 高催化活性

與游離酶相比，酶-MOF 復(fù)合材料的催化活性明顯得到增強。因為MOFs 的高比表面積可以提高酶的負(fù)載量，而且MOFs 除了可以作為固定酶的載體，也可以參與到催化反應(yīng)中。此外，不同孔徑大小的MOFs 對酶分子還具有選擇性。Gascón 等人[14]在溫和條件下，以Fe-MOF 為載體，負(fù)載了葡萄糖氧化酶(GOx)。結(jié)果表明，GOx@Fe-MOF 的活性是游離酶的2.4 倍，這可能是載體與酶之間的相互作用引起的。Cao 等人[15]首次成功將枯草芽孢桿菌脂肪酶(BSL2)包埋到分級介孔材料Cu-BTC 中，固定后的BSL2@Cu-BTC 不僅可重復(fù)使用多次，而且酶活性明顯增強，其初始反應(yīng)速率是游離酶的17 倍左右。

1.3 高穩(wěn)定性

一般情況下，當(dāng)酶暴露在極端溫度、pH 和有機溶劑中時，酶的空間結(jié)構(gòu)或活性位點會被破壞，導(dǎo)致酶的失活。將酶固定到載體上，可以最大限度地減少酶的損失，提高酶對極端環(huán)境的耐受能力。Liang等人[16]將HRP（辣根過氧化物酶）和用ZIF-MOF負(fù)載HRP 的ZIF-MOF/HRP 材料同時放入沸水中（100 ℃）1h，結(jié)果游離酶完全失活，而ZIF-MOF/HRP 仍有88%的活性。在進(jìn)一步的實驗中，HRP和ZIF-MOF/HRP 又被放入沸騰的DMF（153℃）中1h，HRP 同樣失去活性，而有載體保護的ZIFMOF/HRP 在1h 后仍有90%的活性。Xia 等人[17]研究了游離的ANL（曲霉脂肪酶）和ANL@ZnGlu-MOF 對有機溶劑的耐受力。在35℃條件下，將ANL 和ANL@ZnGlu-MOF 放入乙酸乙酯溶液中，3h后，ANL@ZnGlu-MOF 仍保持原始活性的63.2%，而游離的ANL 僅殘留43.0%的活性。復(fù)合材料穩(wěn)定性提高的原因，可能是ANL 被固定到載體表面后，其結(jié)構(gòu)剛性有所增強。

2 MOFs 固定酶的通用方法

1916 年，固定化酶技術(shù)首次被報道。作者在實驗中發(fā)現(xiàn)，通過物理吸附到木炭和氫氧化鋁上的轉(zhuǎn)化酶保留了其催化活性[18]。自此，酶的固定化技術(shù)被廣泛研究，并取得了相當(dāng)大的進(jìn)展。近年來，MOFs 因具有較低的密度、高孔隙率、穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)、巨大的比表面積和可調(diào)控的孔道尺寸等優(yōu)點[19]而備受研究者的青睞，也被廣泛用作酶的固定化材料。目前，酶-MOF 復(fù)合材料的合成主要通過兩種路線：從頭合成（如原位合成）和后合成（如表面吸附、共價鍵連接和孔道包埋）。從頭合成是指在酶分子周圍組裝MOFs 骨架，后合成是指先合成MOFs，然后將酶通過不同的方法固定到MOFs 上。這兩種方法都保持了酶的活性、效率和穩(wěn)定性[20]。表1 總結(jié)了不同酶-MOF 復(fù)合材料的合成方法。

表1 不同酶-MOF 復(fù)合物制備方法及應(yīng)用的總結(jié)Table1 Summary of preparation methods and applicationsofdifferent enzyme-MOF complexes

2.1 表面吸附

吸附法是酶固定化技術(shù)中最簡單、快速、直接的方法。酶與載體通過氫鍵、范德華力、疏水作用、靜電作用等弱相互作用力結(jié)合。這種弱相互作用不僅不會改變酶的自然結(jié)構(gòu)，還能避免酶易聚集在一起的問題[21]。此外，MOFs 的高比表面積可以提高酶的負(fù)載量，功能化后的MOFs 還能夠與酶分子形成更穩(wěn)定的鍵。2006 年，Balkus 等人[22]首次嘗試了以MOFs 為載體固定蛋白質(zhì)分子。在室溫條件下，MP-11(微過氧化物酶-11)在DMF 溶液中通過物理攪拌，成功固定到Cu-MOF 上。為檢測MP-11@MOF 的活性，他們將MP-11@MOF 與亞甲基藍(lán)、過氧化氫進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MP-11@MOF 的轉(zhuǎn)化率高達(dá)(63%±5.1%)，而游離MP-11@MOF 僅有(6%±5.2%)。Liu 等人[23]設(shè)計了一種簡單、快速的方法，成功合成了胰蛋白酶-FITC@MOF 生物反應(yīng)器。他們將熒光黏合劑FITC（異硫氰酸熒光素）先與胰蛋白酶結(jié)合，然后再一起固定到MOFs 上。即使在重復(fù)使用的情況下，胰蛋白酶-FITC@MOF 生物反應(yīng)器也具有極高的消化效率，而且制備過程不需要對MOFs 進(jìn)行表面修飾，避免了揮發(fā)性有機廢物的產(chǎn)生。

2.2 孔道包埋

MOFs 的多孔結(jié)構(gòu)可以將酶固定在孔道中，避免了循環(huán)使用過程中酶會浸出的問題，從而提高了酶的穩(wěn)定性。除此之外，MOFs 的孔徑尺寸也可以選擇某些特定的底物。然而，酶包埋到孔道里，其構(gòu)象可能會發(fā)生變化，因此催化活性是否會受到影響還需實驗驗證。Ma 等人[24]做了一組對照試驗，將肌紅蛋白（Mb，2.1nm×3.5nm×4.4nm）分別固定到介孔MOFs（Tb-meso MOF，孔道直徑為4.7nm）和介孔氧化硅材料（SBA-15，孔徑大小約為8.5nm）上。固定后的Mb 仍保持過氧化物酶的活性。以THB（三羥基苯）為底物，用Mb@Tb-mesoMOF 和Mb@SBA-15 分別對其進(jìn)行氧化。結(jié)果表明，Mb@Tb-mesoMOF 的初始反應(yīng)速率約為游離Mb 的1/2，這是因為底物需要從溶液擴散到MOFs 的孔道中。但是1h 后，Mb@Tb-mesoMOF 的平均速率快于Mb@SBA-15 和游離Mb。在可重復(fù)性實驗中，Mb@Tb-mesoMOF 經(jīng)過16 次循環(huán)，其活性僅降低33%，而Mb@SBA-15 在第3 次循環(huán)后僅剩18%的活性。

2.3 共價鍵連接

通常來說，酶可以通過共價鍵與MOF 牢牢連接。因為MOF 的配體有豐富的官能團如氨基、羧基、羥基等，這些官能團可以與酶表面的活性基團相結(jié)合，提高酶的穩(wěn)定性和循環(huán)使用次數(shù)。在酶與載體固定化的過程中，反應(yīng)基團的密度、空間位阻、穩(wěn)定性耐力會影響到固定化酶的固定效率和性能[25]。Lin 等人[26]為蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用開發(fā)了一種新型生物催化劑。他們以對苯二甲酸為有機配體，合成了MIL-101(Cr)、MIL-88B(Cr)和MIL-88B-NH2(Cr)，作為負(fù)載胰蛋白酶的載體。合成過程中，用二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）活化MOFs 表面的羧基。在水解牛血清蛋白（BSA）的實驗中，胰蛋白酶-MIL-88BNH2(Cr)的水解效率是另外2 個復(fù)合物的2 倍，原因可能是MOFs 表面的氨基與胰蛋白酶上的羧基基團相結(jié)合，增加了胰蛋白酶固定到MOF 表面的數(shù)量。類似地，交聯(lián)劑也可以用來連接酶與MOFs。Lou 等人[27]用戊二醛作為交聯(lián)劑，將大豆環(huán)氧化物水解酶(SHE)與UiO-66-NH2表面的氨基連接，用于水解1,2-環(huán)氧辛烷。與游離酶相比，SHE@ UiO-66-NH2增強了對底物的親和力，催化效率明顯提高。

2.4 原位合成

大多數(shù)MOFs 的孔徑小于酶分子，限制了MOFs對酶的包埋，研究者們開發(fā)了另一合成策略，針對一些合成條件較為溫和的MOFs，可以在固定化過程中，在酶分子周圍組裝MOFs 骨架。這種酶-MOF復(fù)合物不僅可以防止酶分子的浸出，而且MOFs 作為保護殼，也避免了極端環(huán)境（高溫、pH、有機溶劑）對酶的破壞。He 等人[28]報道了一種簡便、有效的原位合成法，將嗜熱脂肪酶QLM 封裝到ZIF-8 中。QLM@ZIF-8 展現(xiàn)了對高溫和pH 的耐受性，在70℃條件下存放5min，仍具有63%的活性，而游離QLM僅剩5%的初始活性。同樣，在pH 為5.0、7.0 和9.0 的環(huán)境中放置200min，QLM@ZIF-8 仍可保持超過90%的活性。ZIF-8 除了可降低外界環(huán)境因素的影響，也能防止胰蛋白酶對脂肪酶的水解。因為ZIF-8 的孔徑明顯小于胰蛋白酶，因此可以有效阻斷其活性位點與QLM 的接觸，從而保持了QLM 的生物活性。Wang 等人[29]首次報道了在溶液介質(zhì)中用Cu-MOF 包埋β-葡萄糖苷酶（β-G）。合成過程中加入的聚乙烯吡咯烷酮（PVP），可防止蛋白質(zhì)聚集。在60℃的高溫下，β-G@Cu-MOF 可維持超過80%的活性，游離β-G 則會失去60%的活性。而且β-G@Cu-MOF 循環(huán)使用10 次后，其活性仍有90%。原位合成法可以簡單、高效地合成酶-MOF復(fù)合物，但是孔徑的限制可能會阻礙酶與大分子底物的接觸，催化效率也許會有所降低。

3 酶-MOF 復(fù)合材料的應(yīng)用

酶-MOF 復(fù)合材料因其眾多優(yōu)點，如催化效率高、穩(wěn)定性好、可循環(huán)使用等，已被廣泛投入實際應(yīng)用中。本文總結(jié)了酶-MOF 復(fù)合物在環(huán)境污染物去除方面的應(yīng)用。

漆酶是一種含有多個銅離子的氧化酶，可以氧化酚類、染料、苯胺等有機物。漆酶的反應(yīng)條件溫和、污染少且選擇性高，在污水處理中有重要的應(yīng)用價值[30]。Zhang 等人[31]將漆酶包埋到Cu-MOF(HKUST-1)中，用于去除環(huán)境中的雙酚A。實驗證明，Cu-MOF 不僅可以作為漆酶的保護層，保證其在不同溫度、pH 下的活性，而且固定后漆酶的催化活性與游離酶相比提高了1.5 倍，4h 內(nèi)的降解效率就達(dá)到了100%。為方便酶-MOF 復(fù)合物的回收，Hu 等人[32]首次以氨基功能化的磁性MOF(Fe3O4-NH2@MIL-101(Cr))為載體，通過吸附和共價結(jié)合的方法固定化漆酶，并對2,4-二氯苯酚的去除進(jìn)行了研究。該固定化漆酶在1h 內(nèi)對2,4-二氯苯酚的去除率達(dá)到87%以上，并且反應(yīng)結(jié)束后，可用磁鐵進(jìn)行收集，在下一個循環(huán)中仍能保持其降解能力。Sicard 等人[33]將MP8(微過氧化物酶-8)固定到MIL-101(Cr)納米材料上，用于氧化降解有機染料甲基橙。固定后的酶不僅保持了催化活性，而且對酸性環(huán)境的耐受能力增強。此實驗還證明了MOFs 可與酶協(xié)同作用，提高氧化染料的選擇性。

4 總結(jié)與展望

本文闡述了MOFs 與酶結(jié)合而成的新型復(fù)合材料所具有的優(yōu)勢和4 種常用的合成方法，總結(jié)了酶-MOF 復(fù)合物在污染物去除方面的應(yīng)用。

盡管酶-MOF 復(fù)合材料有許多優(yōu)勢，但這一領(lǐng)域的研究仍處于初級階段，還有一些不足之處需要改進(jìn)。例如，通過表面吸附或共價結(jié)合的方式固定到MOFs 表面的酶，會因暴露在外界環(huán)境中沒有保護，而被蛋白酶消化或在極端條件下失活；只有與MOFs 孔徑相匹配的酶分子才能以孔道包埋的方法與MOFs 結(jié)合。此外，擴散到MOFs 孔道中的酶分子，其構(gòu)象可能會發(fā)生變化，導(dǎo)致酶的活性降低或催化反應(yīng)速率下降。固定化酶的條件必須保證酶的活性不受影響，這使得反應(yīng)介質(zhì)需要在水溶液中進(jìn)行，這在很大程度上限制了MOFs 的合成，所以原位合成法只適用于合成條件溫和的MOFs。

除此之外，酶-MOF 復(fù)合物在許多領(lǐng)域仍存在一些挑戰(zhàn)。例如，酶與MOFs 之間的相互作用需要深入、系統(tǒng)地研究，因為這可以最大程度地減少酶在固定化過程中出現(xiàn)的浸出、失活等問題，保證酶-MOF 復(fù)合物的生物活性。在催化方面，MOFs與酶的協(xié)同催化作用目前研究得并不充分，可以嘗試對MOFs 表面進(jìn)行修飾或改性，以提高對底物的親和力，從而增加酶與底物的接觸機率。總的來說，我們期待酶-MOF 復(fù)合物的研究，能在未來為環(huán)境應(yīng)用領(lǐng)域帶來新的創(chuàng)新和發(fā)展思路。