黃酮及生物堿類成分體外吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究進(jìn)展

米 曉 張建霞 王艷艷（通訊作者）

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱，150040）

Caco-2細(xì)胞系是由Fogh及其同事通過克隆人類的結(jié)腸癌細(xì)胞建立的，最初用于篩選抗腫瘤藥物的細(xì)胞毒性作用，并用于耐藥機(jī)制研究。研究發(fā)現(xiàn)Caco-2細(xì)胞在滲透性濾膜上可自發(fā)進(jìn)行上皮樣分化，形成與正常的小腸上皮相似的單層膜，也具有緊密連接和微絨毛，該模型亦含有多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、受體和代謝酶，如細(xì)胞色素P450 1A（CYP1A）、硫轉(zhuǎn)移酶（SULTs）、UDP-葡萄糖醛糖基轉(zhuǎn)移酶（UGTs）和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）等。因而，Caco-2細(xì)胞模型是最佳的模擬腸上皮細(xì)胞的體外替代模型，常用于體外藥物跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究，從而可進(jìn)一步預(yù)測藥物在人小腸中吸收情況。國內(nèi)外研究顯示，采用Caco-2細(xì)胞模型來研究中藥中的生物堿類和黃酮類化合物的應(yīng)用最廣泛[1]。

本文旨在通過檢索國內(nèi)外文獻(xiàn)，總結(jié)黃酮類及生物堿類化合物在Caco-2細(xì)胞模型中的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的特點(diǎn)。其中，中文文獻(xiàn)資料來源于中國知網(wǎng)，采用主題詞“Caco-2”搭配“黃酮”或“生物堿”及“吸收”、“轉(zhuǎn)運(yùn)”等副主題詞，在全部文獻(xiàn)范圍內(nèi)進(jìn)行模糊檢索。英文文獻(xiàn)來源于Pubmedplus課題輔助分析與智能選刊投稿系統(tǒng)（醫(yī)知網(wǎng)），采用“Caco-2”和“flavone”或“alkaloid”及“absorb”、“transport”等搭配，在全部文獻(xiàn)范圍內(nèi)檢索。

1 黃酮類化合物在Caco-2細(xì)胞模型中的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)特點(diǎn)

1.1 常見中藥中黃酮類成分的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)特點(diǎn)：研究表明黃酮類化合物主要通過主動轉(zhuǎn)運(yùn)、被動轉(zhuǎn)運(yùn)以及擴(kuò)散的方式進(jìn)入Caco-2細(xì)胞。[2]時(shí)間、藥物濃度、溫度及pH均可影響Caco-2細(xì)胞對黃酮類物質(zhì)的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)。部分黃酮類化合物在生物條件下，可自發(fā)轉(zhuǎn)化為酚酸和醛，其中多酚在人體內(nèi)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化過程中，第一階段包括氧化、還原和水解，這些轉(zhuǎn)變發(fā)生的頻率較低，第二相轉(zhuǎn)變包括不同形成的共軛反應(yīng)（甲基，葡萄糖醛酸），此過程比肝臟和腸道發(fā)生的生物轉(zhuǎn)化更強(qiáng)烈。表1主要選取了一支蒿、水飛薊、葒草、葛根、丹參、仙茅、紅花、燈盞細(xì)辛、旱芹、補(bǔ)骨脂、短葶飛蓬、黃芩、甘草、金蓮花14種藥物[3-12]，總結(jié)了Caco-2細(xì)胞對不同中藥中黃酮類化合物吸收的研究。

在所涉及的中藥中，除一枝蒿的主要成分6-去甲氧基-4′-O-甲基菌陳色原酮、仙茅中的仙茅苷轉(zhuǎn)運(yùn)方式為主動轉(zhuǎn)運(yùn)外，其他均以被動轉(zhuǎn)運(yùn)為主，包括水飛薊賓水飛薊賓葡甲胺、槲皮素、山柰酚、葛根中的大豆苷元和芒柄花素、旱芹中的芹菜素、甘草 中 的 licochalcone B、licochalcone C、echinatin、liquiritigenin。補(bǔ)骨脂中的新補(bǔ)骨脂異黃酮轉(zhuǎn)運(yùn)方式既有主動轉(zhuǎn)運(yùn)，也有被動轉(zhuǎn)運(yùn)，其轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為P-gp、MRP2、BCRP底物，金蓮花中的成分其轉(zhuǎn)運(yùn)方式均受P-gp、MRP2蛋白的影響，葒草素、牡荊素、2’-O-β-L-galactopyranosylorientin、2’-O-β-L-galactopyranosylvitexin轉(zhuǎn)運(yùn)方式包括主動轉(zhuǎn)運(yùn)和被動轉(zhuǎn)運(yùn) ，isoswertisin、isoswertiajaponin、2’-O-(2’’’-methylbutanoyl)轉(zhuǎn)運(yùn)方式為被動轉(zhuǎn)運(yùn)。

在分析過程中發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物在Caco-2細(xì)胞模型中轉(zhuǎn)運(yùn)方式主要為被動轉(zhuǎn)運(yùn)，呈現(xiàn)時(shí)間以及濃度依賴性，在所涉及的外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中，受P-gp影響的黃酮類化合物居多，在37℃、酸性條件下吸收較好。黃酮類化合物的吸收非常復(fù)雜，早期主要認(rèn)為其吸收程度與分子的親脂性和糖基化有關(guān)，但最近大量研究表明，黃酮類化合物的吸收與膜表明面的轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白及酶的作用密切相關(guān)。用具有緊密聯(lián)結(jié)的Caco-2細(xì)胞單層可系統(tǒng)地評價(jià)化合物穿過小腸最主要的轉(zhuǎn)運(yùn)屏障——小腸上皮細(xì)胞的各個(gè)步驟，有效的分析各種影響藥物透過小腸上皮轉(zhuǎn)運(yùn)的物理化學(xué)和生化因素，從而預(yù)測黃酮類化合物的生物利用度。

1.2 化學(xué)結(jié)構(gòu)對黃酮類化合物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的影響：Tian等[13]人為了研究黃酮類化合物結(jié)構(gòu)-滲透性關(guān)系，進(jìn)行了36種黃酮類化合物（包括黃酮，黃酮醇，二氫黃酮，二氫黃酮醇，異黃酮，查爾酮等）在Caco-2細(xì)胞模型中的的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞攝取研究。結(jié)果表明，親脂性結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)，游離羥基的數(shù)量和位置，Caco-2細(xì)胞的積聚和外排等因素在黃酮類化合物跨Caco-2細(xì)胞單層的轉(zhuǎn)運(yùn)中起關(guān)鍵作用。Zhu等[14]人利用Caco-2細(xì)胞模型和大鼠血腦屏障細(xì)胞對葛根素，蘆丁，橙皮苷，槲皮素，染料木黃酮，山奈酚，芹菜素和異甘草素8種對心腦血管有益的黃酮類化合物進(jìn)行了滲透性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖苷和羥基數(shù)目的增加不利于黃酮類化合物的在細(xì)胞中的滲透，且羥基位置對細(xì)胞滲透性也有一定影響，鄰羥基苯的滲透性要高于間羥基苯。Deprez，S[15]等人用Caco-2細(xì)胞滲透模型研究了proanthocyanidins（PAs）和（1）-catechin monomer的腸吸收特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對于槲皮素和白楊素這種羥基化程度較低而以被動轉(zhuǎn)運(yùn)方式透過腸上皮細(xì)胞的化合物，proanthocyanidins（PAs）和（1）-catechin monomer 主要通過細(xì)胞旁路途徑進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。Fang[16]等人在有或無維拉帕米的情況下對27種黃酮類化合物在Caco-2細(xì)胞中的攝取和排出進(jìn)行了研究，結(jié)果表明在存在 4′-OCH3，3′-OCH3，并且不存在 3′-OH、3-OH和4′-OH的情況下黃酮類化合物與P-gp結(jié)合較為困難，更有利于對黃酮類化合物的攝取。Liu[17]等人利用Caco-2細(xì)胞研究金線蓮中其中黃酮類化合物的腸道吸收機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C-7處的羥基或甲氧基決定了外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的參與，C-2''存在游離態(tài)羥基的是P-糖蛋白（P-gp）的底物，此外，C-2'處的游離羥基還決定了是多重耐藥蛋白2（NRP2）的底物。

1.3 外排蛋白對黃酮類化合物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的影響：Caco-2細(xì)胞含有許多與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的酶或載體，如肽酶 、酯酶，P-gp、肽、有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體和有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體等。P-gp是一種外排轉(zhuǎn)運(yùn)體，其在Caco-2細(xì)胞中高度表達(dá)。李素云等[18]人利用Caco-2細(xì)胞研究了P-gp對槲皮苷腸道吸收過程中跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P-gp會將進(jìn)入腸上皮細(xì)胞的槲皮苷泵出到腸腔，從而影響槲皮苷的腸道吸收，但其對槲皮苷在腸道吸收過程中的動態(tài)吸收特征和代謝轉(zhuǎn)化沒有影響。

1.4 pH對黃酮類化合物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的影響：陳浩等[19]人研究了葒草花中提取的5種黃酮類化合物在pH為5.0、6.0和7.4在Caco-2細(xì)胞中的吸收特性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃酮類化合物在酸性條件下更有利于吸收，這可能與其化合物本身含有酚羥基酸性基團(tuán)有關(guān)。當(dāng)化合物呈酸性時(shí)，在中性和偏堿性的環(huán)境中以電離形式存在，導(dǎo)致其提取物在細(xì)胞膜的滲透性降低。郭閃[20]等人研究了芹菜素在Caco-2細(xì)胞中的攝取研究，對PH考察的結(jié)果顯示當(dāng)pH＜7.4時(shí)，其攝取量隨著pH值升高而增加，pH＞7.4時(shí)攝取量下降，表明中性條件下攝取較好，酸性條件下不利于其攝取，芹菜素在小腸中的吸收可能較胃中好。

2 生物堿類化合物在Caco-2細(xì)胞模型中的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)特點(diǎn)

生物堿類化合物是科學(xué)家研究最早的一類具有多種生物活性的重要天然有機(jī)化合物，常用中藥的該類有效成分主要具有鎮(zhèn)痛、止痙、抗高血壓、抗心律失常、抗腫瘤以及抗菌消炎等作用。2009年至2015年間，基于Caco-2模型研究生物堿類成分的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的相關(guān)研究較多，但近年來逐漸減少。

現(xiàn)將數(shù)據(jù)庫中篩選罌粟、麻黃、北豆根、苦參、苦參、黃連、延胡索、烏頭、漢防己、烏頭、吳茱萸、黑順片、藜蘆等13種藥物，介紹了Caco-2細(xì)胞對其黃酮類化合物吸收的研究[21-26]：表2所示，生物堿類化合物在Caco-2細(xì)胞模型中轉(zhuǎn)運(yùn)方式主要為被動轉(zhuǎn)運(yùn)，多數(shù)化合物P ratio值偏低。與黃酮類化合物相比，生物堿類化合物的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)受時(shí)間、溫度、Ph以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響較小。該類成分已發(fā)表的文章較少，期待對此類化合物有更多的研究發(fā)現(xiàn)。

3 小結(jié)與展望

Caco-2細(xì)胞模型被認(rèn)為是最常見的考察藥物體外吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的模型，該模型對中藥黃酮類和生物堿類化合物腸吸收的研究具有重要意義。通過對兩類成分的腸代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的研究，為指導(dǎo)、設(shè)計(jì)、遴選口服中藥及其劑型和評估其在體內(nèi)安全性的奠定基礎(chǔ)。[27-31]然而，該模型仍然存在一些異質(zhì)性和局限性，如Caco-2細(xì)胞與腸道細(xì)胞的主要區(qū)別是Caco-2細(xì)胞沒有黏液層，盡管有學(xué)者已經(jīng)進(jìn)行了與Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)粘蛋白分泌細(xì)胞系（HT-29）的研究，但沒有給出預(yù)期的結(jié)果。此外，Caco-2細(xì)胞模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在不同實(shí)驗(yàn)室之間的重復(fù)性差也成為該模型推廣的壁壘。因此，有必要對該細(xì)胞起源、傳代數(shù)、孵化時(shí)間等重要參數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化研究。

表1 Caco-2細(xì)胞模型中生物堿類化合物的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)