TIP30基因敲除小鼠EGFR下游信號(hào)通路活性

陳逢生1 陳曉華2 李愛民1 周瑾1 羅榮城1★

·論著·

TIP30基因敲除小鼠EGFR下游信號(hào)通路活性

陳逢生1 陳曉華2 李愛民1 周瑾1 羅榮城1★

目的探討TIP30基因敲除后是否影響小鼠EGFR下游信號(hào)通路的活性。方法獲取野生型及TIP30基因敲除的BALB/c小鼠乳腺組織及乳腺癌組織，用免疫組化檢測(cè)EGFR下游信號(hào)通路相關(guān)分子pAKT及pErk1/2的表達(dá)。結(jié)果Tip30-/-小鼠乳腺上皮細(xì)胞pErk1/2及pAkt陽性率分別為（27.83±8.46）％和（30.83±6.65）％（n=4），顯著高于Tip30+/+小鼠乳腺上皮細(xì)胞的（12.58±5.87）％和（14.94±5.77）％（n=4），P值分別0.02和0.011。而Tip30-/-小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞pErk1/2及pAkt陽性率分別為（51.68±8.57）％和（56.08±8.44）％（n=4），則顯著高于Tip30-/-小鼠乳腺上皮細(xì)胞陽性率，P分別為0.002和0.001。結(jié)論TIP30基因缺失可能通過使EGFR下游ERK/MAPK及PI3K/AKT信號(hào)通路的活化，從而導(dǎo)致TIP30基因缺失小鼠發(fā)生乳腺癌。

TIP30；表皮生長(zhǎng)因子受體；乳腺癌

TIP30基因，又稱CC3或Htatip2，是1998年肖華等在研究人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的體外轉(zhuǎn)錄時(shí)發(fā)現(xiàn)一種分子量為30 kD的Tat（transactivator of transcription）結(jié)合蛋白（tat interactive protein）［1］。研究發(fā)現(xiàn)TIP30在多種腫瘤組織中表達(dá)異常，如肺癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝細(xì)胞癌和前列腺癌等［2-7］，提示TIP30與腫瘤之間存在密切聯(lián)系。Hua等研究發(fā)現(xiàn)，TIP30基因敲除小鼠可以自發(fā)形成多種腫瘤［7-8］。這些研究提示TIP30是一種腫瘤抑制基因。TIP30具有多種功能，可以作為一種轉(zhuǎn)錄共分子參與凋亡及增殖相關(guān)基因的調(diào)控［9-10］，它還可以作為細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)抑制因子調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡［11］。近年已有研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌和肺癌中，TIP30可以調(diào)控EGFR下游信號(hào)通路的活性［12-13］。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)，在BALB/c背景的小鼠中敲除TIP30能誘發(fā)小鼠乳腺癌發(fā)生［14］。然而在該模型的乳腺及乳腺癌組織中，TIP30是否具有調(diào)控EGFR下游信號(hào)通路的作用仍未明確。為了進(jìn)一步研究其可能的機(jī)制，我們對(duì)該小鼠模型EGFR下游信號(hào)分子進(jìn)行了初步的探討。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)

通過雜交的方法，獲得Tip30基因敲除的BALB/c小鼠，連續(xù)傳代7代以上，獲得純合背景的Tip30-/-BALB/c小鼠。Tip30基因敲除的BALB/c小鼠均由美國(guó)密西根州立大學(xué)肖華實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。共47只雌性小鼠均在南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心SPF級(jí)層流柜內(nèi)分籠飼養(yǎng)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處死和標(biāo)本處理

所有小鼠均為同系來源，共有47只雌性未孕小鼠完成18個(gè)月的實(shí)驗(yàn)觀察并進(jìn)入實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，其中Tip30+/+BALB/c小鼠19只和Tip30-/-BALB/c小鼠28只。所有小鼠均以二氧化碳吸入處死，并詳細(xì)檢查小鼠乳腺及其它器官腫瘤發(fā)生情況。用4％多聚甲醛固定全部小鼠乳腺及腫瘤組織，組織在4℃下過夜，然后用30％、50％、70％梯度酒精對(duì)組織脫水各30 min，滴加二甲苯3次，使其脫脂及透明，然后用石蠟包埋。部分組織立即置于液氮中凍存，最后放入-80℃冰箱中保存。

1.3石蠟切片免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry paraffin chemical，IHC）檢測(cè)

將3～5 μm石蠟切片置于二甲苯中浸泡10 min，更換二甲苯后再浸泡10 min；然后于100％、90％、80％、70％梯度酒精水化各浸泡2 min；去離子雙蒸水洗2次。

1.3.2抗原修復(fù)

應(yīng)用高壓熱修復(fù)法。首先配置存儲(chǔ)溶液A： 0.1 mol/L Citrate Acid，溶液B：0.1 mol/L Sodium Citrate.于4℃長(zhǎng)期保存。工作液配置：9 mL溶液A+41 mL溶液B+450 mL dH2O，調(diào)整PH為6.0。然后將脫蠟水化后的玻片置于裝有工作液的燒杯中，高壓鍋內(nèi)高壓20 min，121℃，壓力15psi。然后于室溫內(nèi)放置30 min待其冷卻。

1.3.3免疫組織化學(xué)染色

將組織切片脫蠟水化后，置入3％H2O2溶液室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，降低染色背景。應(yīng)用PBST浸洗組織切片3次，各5 min。然后用5％BSA-PBST封閉液（150 μL/片）封閉組織1 h。同時(shí)準(zhǔn)備一抗，根據(jù)各抗體稀釋需要，應(yīng)用5％BSA-PBST稀釋配置抗體，兔抗小鼠pAkt單克隆抗體（Cell Signaling）和兔抗小鼠pErk1/2單克隆抗體（Cell Signaling）均按1∶100稀釋。吸除切片上的封閉液，加入事先配好的一抗（150 μL/片），隨后將切片置于濕盒內(nèi)，4℃孵育過夜。第二天應(yīng)用PBST浸洗切片3次，每次5 min。根據(jù)一抗種屬選擇并滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素結(jié)合的二抗（用1％BSA-PBST稀釋液按1∶200稀釋），于室溫孵育30 min。同時(shí)配好ABC（美國(guó)Vector Laboratories公司）工作液（用PBST按1∶100稀釋，并混合均勻），于室溫放置30 min。室溫孵育完成后，用PBST浸洗切片3次，每次5 min。切片滴加ABC液150 μL/片，室溫孵育30 min后，用PBST浸洗3次，每次5 min。隨后用新鮮配制的0.5 mg/mL的DAB顯色液顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，決定顯色時(shí)間，顯色完成后蒸餾水終止顯色反應(yīng)。應(yīng)用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核1.5 min，雙蒸水沖洗15 min。應(yīng)用90％酒精、100％酒精脫水各2次，每次10s，二甲苯透明2次，每次10 s。最后用永久封片液封片，并將切片置于顯微鏡下觀察。

1.3.4乳腺組織及腫瘤組織中pAkt、pErk1/2細(xì)胞計(jì)數(shù)方法

將每個(gè)切片置于光學(xué)顯微鏡（Olympus公司）5個(gè)高倍視野（10×40倍）下進(jìn)行觀察，胞漿、胞核染色為棕黃或棕褐色為陽性細(xì)胞。分別統(tǒng)計(jì)乳腺組織中、腫瘤組織中陽性細(xì)胞數(shù)百分比，取平均值。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

其中兩電平VSC的接地需求包括2個(gè)方面：(1)交流側(cè)濾波器的接地需求；(2)直流側(cè)電容的接地需求。由于VSC電平數(shù)少，采用高頻脈寬調(diào)試方式，開關(guān)頻率高，換流器出口將含有較大的高次諧波，需在變壓器閥側(cè)加裝較小容量的高頻諧波濾波器。VSC在直流線路上有集中電容，可采取電容中點(diǎn)直接接地或通過組件接地的方式，如圖1所示。

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以表示，均數(shù)比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，28只Tip30-/-小鼠中有8只發(fā)現(xiàn)乳腺自發(fā)腫瘤（發(fā)病率28.6％），而19只Tip30+/+小鼠中均未發(fā)現(xiàn)有乳腺自發(fā)腫瘤（0％）；對(duì)TIP30基因敲除小鼠形成的乳腺癌組織進(jìn)行H＆amp;E染色發(fā)現(xiàn)［14］，該模型乳腺癌組織為中分化浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，癌組織存在非典型上皮細(xì)胞組成的腺樣、管狀、巢狀和微乳頭結(jié)構(gòu)。為了進(jìn)一步探討小鼠TIP30基因敲除后形成的乳腺癌組織EGFR下游信號(hào)通路可能的變化，我們對(duì)PI3K及MAPK相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行了研究，結(jié)果如下：

2.1TIP30基因敲除可致小鼠乳腺及腫瘤EGFR下游PI3K信號(hào)通路的活化

為了檢測(cè)TIP30基因敲除對(duì)EGFR下游PI3K信號(hào)通路的影響，我們應(yīng)用免疫組化檢測(cè)小鼠乳腺及腫瘤組織的pAKT活化情況。檢測(cè)結(jié)果如圖1和表1示，應(yīng)用方差分析法，Tip30-/-小鼠乳腺組織中pAKT陽性細(xì)胞百分率為（30.83±6.65）％（n=4），顯著性高于Tip30+/+小鼠乳腺上皮細(xì)胞的pAkt陽性率（14.94±5.77）％（n=4），P=0.011；而Tip30-/-小鼠乳腺腫瘤組織pAkt陽性率（56.08±8.44）％（n=4）則顯著性高于Tip30-/-小鼠乳腺組織，P=0.001。

2.2TIP30基因敲除可致小鼠乳腺及腫瘤EGFR下游MAPK信號(hào)通路的活化

為了進(jìn)一步檢測(cè)TIP30基因敲除后對(duì)小鼠乳腺及腫瘤組織EGFR下游MAPK通路的影響，我們同樣應(yīng)用了免疫組化對(duì)小鼠乳腺及腫瘤組織進(jìn)行檢測(cè)。見圖1和表1，Tip30+/+小鼠乳腺組織pErk1/2陽性細(xì)胞百分率為（12.58±5.87）％（n=4），顯著性低于Tip30-/-小鼠乳腺上皮細(xì)胞（27.83±8.46）％（n=4），P=0.021；而Tip30-/-小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞pErk1/2陽性率為（51.68±8.57）％（n=4），顯著高于Tip30-/-小鼠乳腺組織，P=0.002。

3　討論

TIP30基因作為一種腫瘤抑制基因，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起了重要的作用［2-7］。研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤組織中TIP30表達(dá)異常，而且TIP30基因敲除小鼠可以形成多種腫瘤［7-8］。近來研究還發(fā)現(xiàn)，在肝癌和肺癌中，TIP30可以調(diào)控EGFR細(xì)胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和下游信號(hào)通路的活性［12］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)TIP30基因敲除的BALB/c小鼠中，28％的小鼠能自發(fā)形成乳腺癌。而本研究對(duì)該模型小鼠EGFR信號(hào)分子通路的改變進(jìn)行了初步的探討，發(fā)現(xiàn)TIP30缺失會(huì)導(dǎo)致EGFR下游信號(hào)通路的活化，而這可能是TIP30基因敲除小鼠形成乳腺癌的原因之一。

表1　免疫組化檢測(cè)小鼠乳腺組織及Tip30-/-乳腺腫瘤pErk和pAkt陽性細(xì)胞率（％，±s）Table 1Percentage of pErk and pAkt positive cells in mouse mammary gland and Tip30-/-mammary tumor by IHC（％，x±s）

表1　免疫組化檢測(cè)小鼠乳腺組織及Tip30-/-乳腺腫瘤pErk和pAkt陽性細(xì)胞率（％，±s）Table 1Percentage of pErk and pAkt positive cells in mouse mammary gland and Tip30-/-mammary tumor by IHC（％，x±s）

Genotype Tip30+/+mammary gland Tip30-/-mammary gland Tip30-/-mammary tumor F value P value n 4 4 4 pAKT positive cells（％）14.94±5.77 30.83±6.65 56.08±8.44 34.708＜0.001 pERK positive cells（％）12.58±5.87 27.83±8.46 51.68±8.57 25.975＜0.001

MAPK信號(hào)傳遞途徑起著極為重要的作用，控制著細(xì)胞多種生理過程，如細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂、死亡等。ERK是MAPK家族的主要成員，遵循MAPKs的三級(jí)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)，即上游激活蛋白→MAPK激酶的激酶（MAPKKK）→MAPK激酶（MAP-KK）→MAPK，它的信號(hào)傳遞途徑是涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育及分裂的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的核心。ERK和其信號(hào)途徑一方面接受大量來自生長(zhǎng)因子、絲裂原、環(huán)境刺激等的信號(hào)，另一方面通過ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)作用于核轉(zhuǎn)錄因子如AP-1、NF-кB等，調(diào)控基因表達(dá)，從而在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起中介和放大信號(hào)的作用。本研究顯示TIP30基因敲除的小鼠乳腺組織較野生型小鼠的pERK表達(dá)水平明顯上升，并且在乳腺腫瘤組織中有更高的pERK表達(dá)水平。這些結(jié)果提示TIP30基因敲除后，可能通過影響MAPK信號(hào)通路而在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起一定的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)ERK的活性或表達(dá)水平在乳腺癌中明顯升高。Mueller等［15］研究發(fā)現(xiàn)，與18例癌旁正常組織相比，131例原發(fā)性乳腺癌組織存在ERK活性的上調(diào)。Sivaraman等［16］的研究顯示與良性乳腺疾病相比，乳腺癌組織中ERK活性升高5～10倍。因此提示TIP30缺失可能通過調(diào)節(jié)ERK活性來達(dá)到促進(jìn)乳腺癌發(fā)生的作用。

圖1　TIP30基因敲除活化小鼠乳腺及腫瘤組織EGFR下游信號(hào)分子（×400）Figure 1TIP30 deletion activates downsteam molecules of EGFR in mice（×400）

本研究還發(fā)現(xiàn)，EGFR下游PI3K通路在TIP30基因敲除的小鼠乳腺組織中活化明顯強(qiáng)于野生型小鼠，而且TIP30基因敲除的小鼠的乳腺腫瘤組織pAKT表達(dá)更高。提示該通路的激活可能與該小鼠模型乳腺癌的發(fā)生發(fā)展存在一定關(guān)系。既往已經(jīng)有很多研究發(fā)現(xiàn)，PI3K通路的激活不但與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，還與其它多種腫瘤如黑色素瘤、淋巴瘤、前列腺癌、乳腺癌等發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。在PI3K信號(hào)通路中，AKT是信號(hào)通路中的核心分子，AKT下游包括Nf-kB、VEGF、FOXO等等，是促增殖抑凋亡的因子。PI3K/AKT途徑通過抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)低氧和營(yíng)養(yǎng)缺乏的耐受能力，輔助腫瘤生長(zhǎng)。異常活化的PI3K通路還可以阻斷腫瘤細(xì)胞的極化，從而增強(qiáng)其侵襲和轉(zhuǎn)移能力。值得一提的是，研究發(fā)現(xiàn)乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)單純的AKT活化在小鼠體內(nèi)并不足以誘發(fā)乳腺癌［17］，因此提示乳腺癌發(fā)生還和其它多種機(jī)制相關(guān)［8，10］。有數(shù)據(jù)表明，TIP30基因缺失可以增強(qiáng)c-Myc和IGF-1等基因的表達(dá)，提示TIP30基因敲除后可能通過多種機(jī)制來誘導(dǎo)乳腺癌發(fā)生。

因此，本研究通過對(duì)TIP30基因敲除BALB/c小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，TIP30缺失會(huì)導(dǎo)致EGFR下游ERK/MAPK及PI3K/AKT信號(hào)通路的活化，從而導(dǎo)致TIP30基因缺失小鼠發(fā)生乳腺癌，而pERK和pAKT陽性細(xì)胞表達(dá)率是否存在關(guān)聯(lián)仍有待我們進(jìn)一步研究。本研究對(duì)TIP30基因及其相關(guān)EGFR信號(hào)通路的研究，進(jìn)一步闡明了乳腺癌發(fā)生的可能分子機(jī)制，還為尋找乳腺癌治療潛在靶點(diǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)。

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EGFR downstream signal molecules in TIP30 knockout mice

CHEN Fengsheng1，CHEN Xiaohua2，LI Aimin1，ZHOU Jin1，LUO Rongcheng1★
（1.The Combination of Traditional Chinese and Western Medicine Hospital Cancer Center of Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510315；2.Oncology Center of Panyu District Hospital in Guangzhou City，Guangzhou，Guangdong，China，511400）

ObjectiveTo investigate whether deletion of TIP30 in mice affect activity of EGFR downstream signal molecules.MethodsMammary glands and breast cancer tissues of Tip30+/+and Tip30-/-BALB/c mice were obtained.pAKT and pErk1/2 were detected in these samples by immunohistochemistry. ResultsPositive rates of pErk1/2 and pAkt in Tip30-/-mice mammary gland were（27.83±8.46）％and（30.83±6.65）％（n=4），which were significantly higher than（12.58±5.87）％and（14.94±5.77）％in Tip30+/+mice respectively.P values were 0.02 and 0.011.Moreover，positive rates of pErk1/2 and pAkt in Tip30-/-mice mammary tumor were（51.68±8.57）％and（56.08±8.44）％，significantly higher than Tip30-/-mice mammary gland，P values were 0.002 and 0.001 respectively.ConclusionDeletion of TIP30 in BALB/c mice resulted in mammary tumor partly through upregulation of EGFR downstream signal molecules activity.

TIP30；EGFR；Breast cancer

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金（B2014267）；廣州市番禺區(qū)珠江科技新星專項(xiàng)（2013-專15-6.10）

1.南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腫瘤中心，廣東，廣州510315 2.廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院腫瘤科，廣東，廣州511400

羅榮城，E-mail：lrc01@163.com