靶向沉默黑色素瘤細(xì)胞Pim-1 基因?qū)ζ涞蛲龅鞍妆磉_(dá)的影響

崔自重

( 長(zhǎng)沙市第三醫(yī)院 湖南 長(zhǎng)沙 410015)

黑色素瘤是起源于皮膚黑素細(xì)胞的常見皮膚腫瘤，具有惡性程度高、轉(zhuǎn)移快、預(yù)后差等特點(diǎn)。隨著該疾病在我國(guó)的發(fā)病率急速增加，病死率也呈現(xiàn)一定的上升趨勢(shì)[1]。黑色素瘤放化療療效欠佳，多以手術(shù)切除為主。但單純手術(shù)也不能很好提升患者的生存期，分子生物學(xué)技術(shù)是今后腫瘤治療的主要方向。腫瘤的生物治療通過(guò)RNA 干擾或特異性沉默腫瘤誘發(fā)基因來(lái)影響腫瘤細(xì)胞與外基質(zhì)的黏附，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)[2]。Pim-1 是一種保守的絲氨酸或蘇氨酸蛋白激酶基因，主要通過(guò)磷酸化途徑使底物特異性的失活，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖。已有研究發(fā)現(xiàn)，Pim-1 在黑色素瘤患者體內(nèi)表達(dá)非?；钴S，表明該基因?qū)16 細(xì)胞的生物學(xué)行為具有一定影響。

1.材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

2019 年3 月—10 月期間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。人黑色素瘤細(xì)胞（B16）由長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院新型藥物制劑研發(fā)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地（平臺(tái)編號(hào)2016TP1029）提供；新生牛血清購(gòu)于濟(jì)南勁牛生物科技有限公司；凋亡檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞總蛋白提取試劑盒購(gòu)于上海貝博生物試劑公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購(gòu)于Sigma公司，二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Pim-1 抗體（1:1000）、Bax（1:1000）抗體、Bad（1:1000）抗體均購(gòu)于Abcam 公司（中國(guó)）。

1.2 分組方法

取人黑色素瘤細(xì)胞，根據(jù)是否沉默Pim-1 基因分為對(duì)照組和試驗(yàn)組。對(duì)照組（B16 細(xì)胞）：取B16 細(xì)胞用含有10.0%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液（含濃度100μ/mL 青霉素、鏈霉素。pH=7.2 ～7.4）在37℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)和傳代。試驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染B16 后沉默Pim-1 基因）：同樣用含有10.0%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同對(duì)照組。待細(xì)胞完全貼壁后，吸出各孔培養(yǎng)液，加入100μL不含牛血清的培養(yǎng)基，再加入Pim-1 基因。感染時(shí)間為90min，每15min 輕微晃動(dòng)培養(yǎng)液一次。90min 后吸出無(wú)血清的培養(yǎng)液，置于37℃、5.0% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)和傳代[3-4]。

1.3 數(shù)據(jù)采集

（1）細(xì)胞增殖指數(shù)：將B16 細(xì)胞按照8000/孔的密度接于22 孔培養(yǎng)板中，每孔5 組，置于37℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)和傳代，試驗(yàn)組培養(yǎng)5h 后轉(zhuǎn)染Pim-1 質(zhì)粒，分別在12h、24h 以及48h 加入MTT（5mg/mL）20ml，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸出培養(yǎng)上清液，每孔中加入200mL DMSO，待結(jié)晶溶解后測(cè)定570nm處的光密度（D）值，按下列公式計(jì)算兩組細(xì)胞的增殖指數(shù)：增殖率（%）=試驗(yàn)組D 值/對(duì)照組（0h）D 值×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次[5]。細(xì)胞凋亡率：采用Annexin V/PI 染色法測(cè)凋亡率。取兩組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液（細(xì)胞密度為1×107個(gè)/mL），用PBS 清洗兩次，加入相應(yīng)比例（1：1000）的Annexin V 抗體避光染色10min，然后加入適量PBS 溶液和PI 染液混勻，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Annexin V 陽(yáng)性細(xì)胞比例，即為細(xì)胞凋亡率[6]。

（2）細(xì)胞Bcl-2 蛋白質(zhì)、Bax 蛋白質(zhì)、Bad 蛋白質(zhì)的表達(dá)量：該三種蛋白質(zhì)含量檢測(cè)均采用Weatern blomng 法檢測(cè)，一抗分別為Bcl-2（1:1000）、Bax（1:1000）、Bad（1:1000），二抗為辣根過(guò)氧化物酶耦合聯(lián)二擾（1:1000）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。兩組細(xì)胞增殖指數(shù)、凋亡率、Bcl-2、Bax、Bad 蛋白質(zhì)含量均采用（±s）描述，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，三個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較采用F 檢驗(yàn)，而后采用SNK-q 法進(jìn)行兩兩比較。同一指標(biāo)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較用重復(fù)測(cè)量方差分析判定差異具體來(lái)源（組間、時(shí)間、交互）。通過(guò)擬合二分類Logistic 回歸方程綜合分析3 種蛋白表達(dá)水平對(duì)沉默黑色素瘤細(xì)胞Pim-1 基因沉默情況的綜合影響。P＜0.001 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞增殖指數(shù)的比較

時(shí)間越久，各組細(xì)胞的增殖指數(shù)顯著下降（P＜0.001）。三個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，試驗(yàn)組細(xì)胞的增殖指數(shù)顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。重復(fù)測(cè)量F 分析，組間因素（F=113.718，P＜0.001）和時(shí)間因素（F=30.045，P＜0.001）對(duì)細(xì)胞增殖指數(shù)的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，交互因素（F=0.180，P＞0.05）對(duì)細(xì)胞增殖指數(shù)的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 兩組細(xì)胞增殖指數(shù)的比較（±s）

表1 兩組細(xì)胞增殖指數(shù)的比較（±s）

注：與24h 比較 a P ＜0.001；與48h 組比較 b P ＜0.001。

組別 n 24h 48h 96h F P試驗(yàn)組 110 9.15±1.67 4.08±1.14a 1.67±0.35ab 1176.590 ＜0.001對(duì)照組 110 13.25±1.95 5.24±1.46a 1.94±0.32ab 1881.185 ＜0.001 t - 280.532 43.138 35.656 - -P - ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 - -

2.2 兩組細(xì)胞凋亡率的比較

時(shí)間越久，各組細(xì)胞的凋亡率顯著升高（P＜0.001）。三個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，試驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。重復(fù)測(cè)量F分析，組間因素（F=150.559，P＜0.001）和時(shí)間因素（F=107.547，P＜0.001）對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，交互因素（F=5.592，P＞0.05）對(duì)細(xì)胞增殖指數(shù)的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 兩組細(xì)胞凋亡率的比較（±s）

表2 兩組細(xì)胞凋亡率的比較（±s）

注：與24h 比較 aP ＜0.001；與48h 組比較bP ＜0.001。

組別 n 24h 48h 96h F P試驗(yàn)組 110 1.27±0.53 2.82±0.64a 4.06±0.82ab 933.861 ＜0.001對(duì)照組 110 1.11±0.46 1.34±0.58a 1.87±0.60ab 91.473 ＜0.001 t - 3.775 322.981 511.014 - -P - 0.053 ＜0.001 ＜0.001 - -

2.3 兩組細(xì)胞Bcl-2、Bax、Bad 蛋白表達(dá)含量的比較

試驗(yàn)組細(xì)胞的Bcl-2 蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（P＜0.001），試驗(yàn)組細(xì)胞的Bax、Bad 蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.001），見表3。

表3 兩組細(xì)胞Bcl-2、Bax、Bad 蛋白表達(dá)含量的比較（±s）

表3 兩組細(xì)胞Bcl-2、Bax、Bad 蛋白表達(dá)含量的比較（±s）

組別 n Bcl-2 蛋白 Bax 蛋白 Bad 蛋白試驗(yàn)組 110 1.14±0.31 0.95±0.28 1.18±0.34對(duì)照組 110 2.11±0.45 0.66±0.17 0.77±0.13 t-346.614 86.216 139.555 P-＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 Bcl-2、Bax、Bad 蛋白定量檢測(cè)對(duì)B16 細(xì)胞Pim-1 基因沉默情況的綜合影響

3 種蛋白和B16 細(xì)胞Pim-1 基因沉默情況擬合的回歸方程有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=106.110，P ＜0.001）。3 種蛋白對(duì)Pim-1 基因沉默情況綜合影響依次為：Bcl-2 蛋白、Bad 蛋白、Bax 蛋白，見表4。

表4 Bcl-2、Bax、Bad 蛋白定量檢測(cè)對(duì)B16 細(xì)胞Pim-1 基因沉默情況的綜合影響

3.討論

黑色素瘤具有顯著的早期轉(zhuǎn)移特點(diǎn)，因此手術(shù)切除對(duì)該腫瘤大部分患者的臨床治療具有極大局限性。生物治療作為一種“綠色療法”，可以靶向性的凋亡腫瘤細(xì)胞而調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)。Pim-1 是Pim 家族之一，Pim-1、Pim-2、Pim-3 氨基酸系列具有高度同源性。Pim-1 因能發(fā)揮多種生物學(xué)功能而被廣泛研究，諸多學(xué)者認(rèn)為其能加速凋亡蛋白Bad 磷酸化而抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，原癌基因Pim-1 在前列腺癌、肝癌、胃癌等多種癌癥中均有高水平表達(dá)，因此，靶向調(diào)控B16 細(xì)胞中Pim-1 活性可能有助于改善黑色素瘤患者預(yù)后。

本文發(fā)現(xiàn)，向黑色素瘤B16 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Pim-1 質(zhì)粒能顯著抑制黑色素瘤細(xì)胞B16的表達(dá)，該結(jié)果與Konrad P研究基本一致。進(jìn)一步進(jìn)行組間比較分析發(fā)現(xiàn)，沉默Pim-1 基因能明顯增強(qiáng)黑色素瘤細(xì)胞B16 的凋亡能力。出現(xiàn)這一結(jié)果主要可能與Pim-1 的磷酸化作用有關(guān)，磷酸酶Cdc25A 是一個(gè)正性特異性G1 期調(diào)節(jié)子，它能使cyclin-CDK 復(fù)合物中細(xì)胞周期素依賴性激酶上的15 位酪氨酸殘基去磷酸化，使cyclin-CDK 復(fù)合物活化，促使細(xì)胞周期由G1 期向S 期轉(zhuǎn)化。Pim-1 蛋白具有高保真性和自身組成性激活突變型，其產(chǎn)物Pim-1 激酶是一個(gè)被稱為ATP 錨的活化位點(diǎn)，它的催化結(jié)構(gòu)域覆蓋了從38-290 位的氨基酸區(qū)域，這個(gè)區(qū)域中44-52 位和67 位氨基酸為磷酸鹽結(jié)合位點(diǎn)，Pim-1 基因一方面通過(guò)磷酸化Cdc25A，增強(qiáng)它的磷酸酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡減少、增殖增多，加速細(xì)胞周期G2/M 期的進(jìn)程，最終調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。另一方面，可以通過(guò)調(diào)節(jié)Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)Th 細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)，Runx 基因家族包括Runx1、Runx2、Runx3 三個(gè)成員，是一種轉(zhuǎn)錄因子家族，通過(guò)合成DNA 結(jié)合蛋白，從而在細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Pim-1 和Runx 家族轉(zhuǎn)錄因子共同定位在細(xì)胞核內(nèi)，增加Runx 蛋白的轉(zhuǎn)錄活性，因而導(dǎo)致黑色素瘤細(xì)胞B16 的增殖受到抑制[7-8]。

同時(shí)，試驗(yàn)組細(xì)胞的Bcl-2 表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，試驗(yàn)組細(xì)胞的Bax、Bad 表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。Bcl-2 家族是一組通過(guò)影響線粒體外膜上通透性轉(zhuǎn)換通道的穩(wěn)定性來(lái)調(diào)控細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)，包括抑制凋亡基因與促進(jìn)凋亡基因兩大類，抑制凋亡基因主要有Bcl-2、Bcl-xL 等，通過(guò)增加PT 通道的開放來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因主要有Bax、Bad 等。駱曼[9]指出，靶控Fascin-1 對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞亦會(huì)產(chǎn)生類似效果，兩個(gè)基因是否同效需要后續(xù)驗(yàn)證。Bcl-2 存在于線粒體上，對(duì)線粒體膜具有調(diào)節(jié)功能，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔與Bcl-2 和Bax 之間關(guān)系緊密，細(xì)胞凋亡是一系列高度調(diào)控的半胱氨酸蛋白激酶caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果，由線粒體膜的通透性轉(zhuǎn)化孔開放直接導(dǎo)致[10]。同時(shí)，沉默Pim-1 基因轉(zhuǎn)染的B16 可以通過(guò)抑制Bcl-2 蛋白表達(dá)，來(lái)促進(jìn)Bad、Bax 等凋亡分子表達(dá)而發(fā)揮促凋亡的作用。這說(shuō)明沉默Pim-2 基因?qū)谏亓黾?xì)胞B16 的凋亡和增殖影響與其調(diào)控Bcl-2 家族相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)[11]。Pim-1 激酶能夠直接磷酸化促凋亡BH3-only 蛋白Bad 上112 位絲氨酸，這是Bad 蛋白的一個(gè)失活性守門人位點(diǎn)，Pim-1 激酶通過(guò)抑制Bad 蛋白從而間接提高Bcl-2 的活性，穩(wěn)定線粒體外膜抑制線粒體凋亡蛋白的釋放，促使細(xì)胞因子撤出下的存活。還有研究指出，靶向沉默Pim-1 基因會(huì)影響Stat3 的泛素化和降解過(guò)程，因此Pim-1 激酶對(duì)Bad 蛋白的影響可能存在其他間接途徑，后續(xù)研究需要進(jìn)一步探究。研究還發(fā)現(xiàn)，靶向沉默黑色素瘤細(xì)胞Pim-1 基因沉默后，主要特征蛋白表達(dá)影響從高到低依次為：Bcl-2 蛋白、Bad 蛋白、Bax 蛋白?？砷g接反推，Bcl-2 蛋白精準(zhǔn)、定量檢測(cè)對(duì)黑色素瘤快速篩查可能有一定應(yīng)用價(jià)值。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了靶向沉默Pim-1 基因?qū)谏亓黾?xì)胞發(fā)生凋亡的短期影響，但是本文亦有一定局限性，受限于時(shí)間和經(jīng)費(fèi)，納入觀察的細(xì)胞株及觀測(cè)時(shí)間均相對(duì)較短。同時(shí)，靶向沉默Pim-1 基因在活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中將產(chǎn)生何種具體效果，對(duì)不同腫瘤細(xì)胞增殖情況是否均有等效的抑制效果仍有待觀察。