生物強(qiáng)化修復(fù)合成辣椒素對(duì)序批式反應(yīng)器的影響

徐文倩，葉姜瑜

（重慶大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院，重慶400044）

合成辣椒素又名壬酸香草基胺，具有強(qiáng)烈的抗菌活性〔1〕、抗氧化特性〔2〕，屬于辣椒素類物質(zhì)的一種，廣泛存在于天然辣椒果實(shí)及辣椒加工產(chǎn)品中。我國(guó)是世界上最大的辣椒生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，全國(guó)鮮椒及干椒產(chǎn)量在2016年已超過1 800萬t〔3〕，但生產(chǎn)和加工技術(shù)不夠成熟，尤其在制造辣椒醬料、泡椒、麻辣牛油火鍋底料、辣味食品等加工過程中會(huì)產(chǎn)生大量辛辣廢水。然而，目前鮮有關(guān)于辣椒素或辣椒素類物質(zhì)對(duì)污水處理效果影響的研究。少有的涉及辛辣廢水的研究主要著眼于處理工藝的探討〔4〕，其主要關(guān)注的是辛辣廢水中的油脂和鹽，僅將合成辣椒素視為常規(guī)有機(jī)污染物。類似的情況也發(fā)生在大蒜加工廢水的處理中。已有多項(xiàng)研究表明大蒜加工廢水因?yàn)楦缓哂袕?qiáng)烈殺菌作用的大蒜素，可抑制活性污泥中微生物的生長(zhǎng)，使用生化法處理大蒜加工廢水常難以達(dá)標(biāo)〔5〕。考慮到合成辣椒素也具有強(qiáng)烈的殺菌特性，進(jìn)行合成辣椒素沖擊下污水生化處理系統(tǒng)穩(wěn)定性研究是有必要的。針對(duì)合成辣椒素在廢水處理領(lǐng)域的研究空白，本研究從生化反應(yīng)器處理污染物效率和活性污泥的微生物群落兩方面探討了合成辣椒素對(duì)序批式反應(yīng)器（SBR）的沖擊，并采用間歇性投加降解合成辣椒素的復(fù)合菌劑進(jìn)行生物強(qiáng)化，修復(fù)了合成辣椒素對(duì)SBR的負(fù)面影響，以期為含合成辣椒素廢水的生化處理提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

合成辣椒素（藥用級(jí)，純度99%以上），購自鄒祥生物科技（中國(guó)）有限公司。本實(shí)驗(yàn)采用人工模擬廢水，成分包括：葡萄糖36 g/L，蛋白胨4 g/L，NH4Cl 14 g/L，淀粉8.57 g/L，KH2PO41.6 g/L，16.7 mL/L微量元素溶液。微量元素溶液的組成（g/L）：Fe2（SO4）35，CaCl28，Na2MoO42.6，ZnSO41.03，MgSO423.6，CoCl20.47，MnSO41.08。所有化學(xué)品均為分析級(jí)，購自中國(guó)國(guó)藥控股有限公司。啟動(dòng)SBR反應(yīng)器的活性污泥來自于重慶某污水處理廠氧化溝的濃縮活性污泥。

本實(shí)驗(yàn)所使用的復(fù)合菌劑FJ由3株降解合成辣椒素的功能菌組成，均篩選自100 mg/L合成辣椒素馴化1周后的活性污泥，具體為Serratia marcescens subsp.marcescens Cap B（GenBank登記號(hào)MN508465），Serratia marcescens JK（GenBank登記號(hào)MN788631），和Lactobacillus plantarum subsp.plantarum Cap Z（GenBank登記號(hào)MN508467）。其中Cap Z屬于植物乳桿菌屬，植物乳桿菌可生物降解辣椒素及辣椒素類物質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵辣椒及制作辣椒醬〔6〕。Cap B與JK同屬沙雷氏菌屬，目前尚未有沙雷氏菌屬能降解辣椒素或辣椒素類物質(zhì)的報(bào)道。此外，這3株菌均具有生物安全性，不用擔(dān)心對(duì)環(huán)境的二次污染。將Cap B與JK分別接種在LB培養(yǎng)基中，于轉(zhuǎn)速150 r/min，30℃搖床中培養(yǎng)9 h，Cap Z于MRS培養(yǎng)基中37℃靜置培養(yǎng)10 h后得到3種細(xì)菌的種子液。再將所得種子液于5 000 r/min離心8 min后，棄去上清液，并用0.85%的無菌生理鹽水反復(fù)清洗3次以除去菌體中殘留的培養(yǎng)液，最后用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌懸液的OD600在1.0左右。將3種菌懸液等體積混合后，按體積分?jǐn)?shù)5%的比例向加菌組FJ中投加，每隔15 d投加1次。

1.2 SBR反應(yīng)器的運(yùn)行

本實(shí)驗(yàn)搭建了3組SBR反應(yīng)器，分別標(biāo)記為Con組（對(duì)照組）、Cap組（合成辣椒素組）、FJ組（生物強(qiáng)化組）。3組反應(yīng)器之間有兩個(gè)不同之處：Cap組和FJ組每日分別在進(jìn)水中添加100 mg/L合成辣椒素-甲醇溶液，而Con組只添加等量的甲醇溶液；FJ組每15 d添加5%的復(fù)合菌劑FJ。各反應(yīng)器的有效容積為400 mL，進(jìn)出水量為有效容積的一半，MLSS控制在4.0 g/L，溶解氧維持在1.5~3 mg/L，溫度為（27±0.5）℃。SBR反應(yīng)器一天進(jìn)行4個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)6 h，其中進(jìn)水0.3 h，曝氣4 h，靜置沉淀1.5 h，排水0.1 h。

1.3 樣品采集與測(cè)定

每2 d及試驗(yàn)第5天使用無菌離心管采集進(jìn)出水樣50 mL，經(jīng)0.45μm聚醚砜（PES）膜過濾后取濾液測(cè)定NH4+、TN、TP、COD，測(cè)定方法均參考文獻(xiàn)〔7〕。在試驗(yàn)第5天、第20天、第40天分別于第一個(gè)循環(huán)的同一曝氣階段用無菌離心管收集各組的泥水混合樣，一式三份，并于5 000 r/min離心8 min后棄去上清液以得到活性污泥樣品。將活性污泥樣品儲(chǔ)存在-80℃，用干冰運(yùn)輸至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，在Illumina MiSeq PE300平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。該研究原始測(cè)序數(shù)據(jù)儲(chǔ)存在NCBI SRA數(shù)據(jù)庫，登記號(hào)為SRR10153486~SRR10153494。樣品DNA的提取及PCR擴(kuò)增參考文獻(xiàn)〔8〕的方法，使用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）擴(kuò)增樣品的16S rRNA基因的V3-V4高變區(qū)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

為排除測(cè)序深度不同帶來的誤差，將所有樣本的高通量測(cè)序結(jié)果按最小的序列數(shù)量抽平后，再采用最小序列數(shù)對(duì)其他樣品進(jìn)行隨機(jī)取樣，形成新的子樣品，通過I-Sanger云平臺(tái)進(jìn)行多樣性分析、樣本比較分析、物種組成分析、物種差異分析以及功能預(yù)測(cè)分析等。使用IBM SPSS Statistics 25與Origin 2018進(jìn)行顯著性分析，相關(guān)性分析與線性回歸分析等。其中顯著性分析結(jié)果含義：0.01

2 結(jié)果與討論

2.1 SBR的運(yùn)行性能

3組反應(yīng)器對(duì)污染物COD、NH4+、TN、TP的去除效果見圖1。

圖1 不同反應(yīng)器污染物處理效果

運(yùn)行12 d后，Cap組和FJ組SBR性能穩(wěn)定。試驗(yàn)期間，Cap組的COD、TN、NH4+的平均去除率均顯著低于其他兩組（P＜0.05），但TP的平均去除率受影響較?。≒＞0.05）。復(fù)合菌劑FJ的投加對(duì)進(jìn)水水質(zhì)沒有影響，而合成辣椒素的引入會(huì)增加進(jìn)水COD和TN。所以，F(xiàn)J組COD和TN的去除率高于Con組的原因可能是進(jìn)水COD和TN較高。與Cap組相比，F(xiàn)J組顯著提高了SBR系統(tǒng)對(duì)于合成辣椒素廢水的處理能力。

2.2 微生物群落分析

2.2.1 群落多樣性

所有樣品按最小序列數(shù)35259抽平后進(jìn)行進(jìn)一步的分析?；钚晕勰辔⑸锶郝涞腁lpha多樣性指數(shù)見表1。

表1 不同樣本的Alpha多樣性指數(shù)表

用ANOVA方法對(duì)組間顯著性差異進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果表明群落豐富度（Sobs、ACE、Chao）在Con、Cap、FJ組間差異顯著，而群落多樣性（Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)）差異不顯著?？傊?，Cap組的群落豐富度和多樣性指數(shù)最低，而FJ組的多樣性指數(shù)最高。所有樣本的覆蓋度均大于0.99，說明測(cè)序深度足以覆蓋大部分微生物，甚至包括部分珍稀物種。

為揭示群落Alpha多樣性與污染物去除率之間的相關(guān)性，使用SPSS 23.0.2進(jìn)行了基于Pearson和Spearman相關(guān)性的線性回歸分析，顯著相關(guān)（P＜0.05）的結(jié)果見表2。

表2 污染物去除率與Alpha多樣性的相關(guān)性分析

Sobs、ACE和Chao指數(shù)均反應(yīng)群落豐富度，因此僅選擇了與每個(gè)變量最顯著相關(guān)的多樣性指數(shù)進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，COD、NH4+、TN的去除率與群落豐富度呈顯著正相關(guān)（R2＞0.5，P＜0.05），微生物群落的豐富度可能對(duì)SBR反應(yīng)器的性能起重要作用。

圖2 污染物去除率與群落豐富度的線性回歸圖

Cap組在100 mg/L的合成辣椒素的作用下，SBR系統(tǒng)中活性污泥的微生物群落豐富度顯著降低，群落多樣性略低，某些重要的利于降解污染物的功能屬可能減少甚至消亡。但是Cap組的一些物種的減少并沒有使群落喪失對(duì)污染物的去除功能，而是表現(xiàn)為群落整體對(duì)污染物去除能力的下降。有研究指出微生物群落功能冗余性的存在保證了整體的群落功能不會(huì)輕易喪失，但群落功能的強(qiáng)弱可能會(huì)隨著環(huán)境及反應(yīng)器運(yùn)行條件而有所波動(dòng)〔9〕。加入復(fù)合菌劑FJ后，活性污泥的群落豐富度得到逐步恢復(fù)，進(jìn)而逐漸提高了COD、NH4+、TN的污染物去除率。復(fù)合菌劑FJ由降解合成辣椒素的功能菌株構(gòu)成，其修復(fù)的關(guān)鍵可能在于通過緩解合成辣椒素的作用，恢復(fù)了系統(tǒng)內(nèi)活性污泥的種群豐富度。

2.2.2 群落組成

該研究中，F(xiàn)J組與Con組的活性污泥的微生物群落組成相似，而與Cap組差異較大。進(jìn)一步地，基于MIDAS活性污泥的微生物數(shù)據(jù)庫〔11〕，將樣品中活性污泥的功能屬分為不同的類型，見表3。盡管只有HET（好氧異養(yǎng)細(xì)菌）的累計(jì)相對(duì)豐度和在3組中有顯著差異（P<0.05），但Cap組其他的功能屬PAO（磷酸鹽積累菌）、GAO（糖原積累菌）、AOB（氨氧化菌）、NOB（亞硝酸鹽氧化菌）、NIR（亞硝酸鹽還原菌）的減少，可能也是Cap組污染物去除率有限的原因。此外，在FJ組與Cap組中，PAO/GAO的相對(duì)豐度比均隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間逐漸增加，合成辣椒素的添加可能更利于PAO的增殖，而不是GAO。

Cap組的功能菌群相對(duì)豐度是最低的，并且缺少一些其他兩組均存在的重要功能菌屬如Acidobacterium、Anaerolinea、Flavobacterium、Ferruginibacter、Propioniciclava、Simplicispira、Sorangium、Sphaerotilus、Sphingopyxis、Leucobacter、Terrimonas、Uliginosibacterium、Haliangium，還有Nitrospira。Cap組去污能力的降低一方面可能是因?yàn)槟承┲匾墓δ芫旱南?，即表現(xiàn)為種群豐富度的減少（圖3），另一方面是因?yàn)槭Ｏ碌墓δ芫悍N群數(shù)量上的減少。有研究表明長(zhǎng)期的外界擾動(dòng)可干擾微生物群落原有的穩(wěn)定性，并提高群落轉(zhuǎn)移到替代穩(wěn)定狀態(tài)的可能性〔10〕。亦有研究發(fā)現(xiàn)，一旦微生物群落進(jìn)入替代穩(wěn)定狀態(tài)，群落將難以恢復(fù)到以前的組成或功能〔12〕。替代穩(wěn)定狀態(tài)的存在有助于解釋長(zhǎng)期受合成辣椒素?cái)_動(dòng)下，Cap組群落組成與其他兩組差異較大的現(xiàn)象。后續(xù)研究可利用宏基因組學(xué)檢測(cè)中微生物群落時(shí)空動(dòng)態(tài)變化，更深入揭示在長(zhǎng)期合成辣椒素?cái)_動(dòng)下，活性污泥微生物群落的替代穩(wěn)定狀態(tài)及微生物之間的相互作用。

復(fù)合菌劑FJ的使用恢復(fù)了功能菌群的種類及數(shù)量，從而提高了合成辣椒素沖擊下反應(yīng)器的污染物去除效果。鑒于高通量取樣時(shí)間是每次添加復(fù)合菌劑FJ后的第5天及第10天，此時(shí)復(fù)合菌劑FJ中的菌株在屬水平上的累計(jì)相對(duì)豐度和均小于0.1%。這說明復(fù)合菌劑FJ可能并不是通過持續(xù)地大量定殖于反應(yīng)器中的方式來起作用的。有研究表明，當(dāng)微生物菌劑定殖失敗時(shí)，生物強(qiáng)化仍然是有效的，因?yàn)橥鈦砭鷦┑氖褂每筛淖兾h(huán)境，從而引發(fā)功能菌群的大量增殖〔13〕。在合成辣椒素的長(zhǎng)期擾動(dòng)下，復(fù)合菌劑FJ的投加可能在短時(shí)間內(nèi)就與合成辣椒素進(jìn)行了降解反應(yīng)，逐步改善了污染物降解功能菌的生存機(jī)會(huì)及條件，從微生物群落組成的角度恢復(fù)了群落原有的穩(wěn)定狀態(tài)。

2.2.3 功能預(yù)測(cè)

按參考文獻(xiàn)〔14〕所述，使用PICRUSt及KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)樣品進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，根據(jù)結(jié)果用STAMP篩選3組中顯著不同的代謝途徑及KO，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在KEGG Level 3上3組中存在著顯著不同（P<0.05）的代謝途徑，其相對(duì)豐度總和達(dá)64.31%~66.75%。針對(duì)這些顯著不同的代謝途徑，進(jìn)行了主成分分析（PCA），結(jié)果見圖3。

圖3 KEGG Level 3上顯著不同的功能代謝主成分分析圖

圖3結(jié)果顯示，合成辣椒素的添加可顯著改變活性污泥的功能特性，而復(fù)合菌劑FJ的使用能恢復(fù)這些功能特性（圖3），即表現(xiàn)為FJ組與Con組高度相似的代謝模式。具體而言，在合成辣椒素的作用下增強(qiáng)的代謝途徑包含應(yīng)對(duì)環(huán)境壓力的代謝途徑，比如基因信息處理相關(guān)的代謝中涉及DNA復(fù)制、修復(fù)、翻譯的代謝等，這說明微生物的自我保護(hù)機(jī)制〔15〕被激活。而在合成辣椒素的作用下受到顯著抑制的代謝途徑包含多個(gè)涉及有機(jī)污染物降解的代謝及能量代謝，比如碳水化合物（Carbohydrate metabolism）、氨基酸代謝（Amino acid metabolism）、淀粉和蔗糖代謝（Starch and sucrose metabolism）、氨基糖和核苷酸糖代謝（Amino sugar and nucleotide sugar metabolism）、原核生物中的固碳途徑（Carbon fixation pathways in prokaryotes）、檸檬酸循環(huán)（Citrate cycle）等，從而導(dǎo)致Cap組的活性污泥功能酶活較低且污染物去除率的降低。此外，與脫氮性能有關(guān)的KO中，Cap組中與反硝化有關(guān)KO的相對(duì)豐度（包括K00370，K00371和K00374），還有與亞硝酸鹽減少有關(guān)K00366的相對(duì)豐度均顯著（P<0.05）低于其他兩組。這是Cap組反硝化和同化的亞硝酸鹽還原功能被削弱的證據(jù)。預(yù)測(cè)的微生物功能的結(jié)果從功能酶活及群落功能代謝的角度在一定程度上解釋了不同組之間反應(yīng)器性能差異的原因。Cap組在功能代謝上與其他兩組的顯著不同支持上文Cap組的微生物群落進(jìn)入了一個(gè)新的替代穩(wěn)定狀態(tài)的猜想。復(fù)合菌劑FJ可能通過降解合成辣椒素為功能菌屬提供了適宜的微環(huán)境，恢復(fù)了群落組成及多樣性，進(jìn)而改善了群落功能。值得注意的是，雖然PICRUST的KEGG預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率在活性污泥的微生物群落中達(dá)80%〔14〕，但仍存在誤差。后續(xù)的研究應(yīng)進(jìn)一步引入對(duì)活性污泥功能基因以及相關(guān)功能酶活性的檢驗(yàn)加以驗(yàn)證。

表3 不同組功能菌群的相對(duì)豐度及分類表%

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)在100 mg/L合成辣椒素的沖擊下，活性污泥微生物的群落豐富度顯著減少，以及群落組成明顯改變，相應(yīng)地群落功能從利于污染物降解的代謝模式顯著改變?yōu)閼?yīng)對(duì)環(huán)境壓力的代謝模式，最終造成了SBR反應(yīng)器的污染物處理效率顯著降低。FJ組和Con組相似的群落組成、功能代謝以及污染物去除率表明復(fù)合菌劑FJ的使用有助于維持微生物群落原有的穩(wěn)定狀態(tài)，這可能是復(fù)合菌劑FJ通過降解合成辣椒素和改善微環(huán)境，逐步恢復(fù)了對(duì)合成辣椒素?cái)_動(dòng)敏感的功能菌群的種類與含量，進(jìn)而恢復(fù)了群落的功能來實(shí)現(xiàn)的?？偟膩碚f，該研究為合成辣椒素對(duì)污水生化反應(yīng)器的沖擊首次提供了量化的參考，并提出了一個(gè)有效的利用復(fù)合菌劑進(jìn)行生物強(qiáng)化修復(fù)的方法。