鏈長和陽離子對膽堿脂肪酸皂的細(xì)胞毒性和生物降解力的影響

表面活性劑的Krafft點(diǎn)是其應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一，因?yàn)槠湎薅吮砻婊钚詣┑氖褂脺囟?。只有?dāng)溫度高于krafft溫度時(shí)，膠束才開始形成，溶解度才會大幅度提高，因此表面活性劑才可以發(fā)揮其功能。與降低離子液體的熔點(diǎn)（熔點(diǎn)＜100℃的鹽）類似，可以通過阻礙固態(tài)分子規(guī)則的晶體堆積來降低表面活性劑的Krafft點(diǎn)。因此，與鈉和鉀的同系物相比，在簡單的脂肪酸皂中使用大體積的膽堿陽離子（如圖1所示）作為抗衡離子，對增加相應(yīng)表面活性劑的水溶性非常有效。例如，在環(huán)境溫度下，膽堿脂肪酸皂（ChCm）的鏈長達(dá)到m=16時(shí)依然是可溶解的，而棕櫚酸鈉（NaC16）在60℃以下幾乎不溶。

圖1 膽堿陽離子的結(jié)構(gòu)

膽堿（（2-羥乙基）三甲基銨）大量存在于植物、動物和人體組織中，并且具有良好的生化特性。此外，它還是神經(jīng)傳遞質(zhì)乙酰膽堿以及生物膜主要成分磷脂的前體，其衍生物甜菜堿可作為甲基供體，這對蛋白質(zhì)合成和甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)很重要。早期研究表明，膽堿在環(huán)境中可被某些微生物分解。它們還是在哺乳動物的初級代謝中大量存在的成分組成，因此，膽堿脂肪酸皂也應(yīng)該是對環(huán)境和生理無害的。另外，由于它們的低Krafft點(diǎn)，膽堿脂肪酸皂的合成可以在環(huán)境溫度下進(jìn)行，無須額外提供能量。如今，膽堿鹽（例如氯化物）是低成本的化學(xué)品，每年產(chǎn)量可達(dá)數(shù)百萬噸。因此，膽堿脂肪酸皂不僅具有生物相容性，而且還具有經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢。

近年來，膽堿在綠色離子液體領(lǐng)域引起了人們極大的興趣。已評測了膽堿磷酸根離子液體對J774鼠巨噬細(xì)胞系的細(xì)胞毒性，顯示毒性基本上取決于所用的陰離子。Petkovic等實(shí)驗(yàn)表明，中短鏈脂肪酸膽堿鹽（從乙酸到癸酸，m=2～10））也是離子液體。此外，他們分別使用絲狀真菌和青霉菌作為生物模型對這些化合物的毒性和生物降解性進(jìn)行了評估，發(fā)現(xiàn)這些膽堿離子液體的毒性甚至比鈉離子液體低。膽堿鹽作為有應(yīng)用前途的綠色化學(xué)品，在過去幾年中的多項(xiàng)專利聲明中得到了明顯體現(xiàn)。但是，歐洲化妝品管理規(guī)范76/768/EEC（Anex II/168）仍然禁止在化妝品中使用膽堿鹽。這主要是因?yàn)槟憠A屬于季銨化合物（QAC），而季銨化合物通常具有內(nèi)在的刺激潛力。

為了檢驗(yàn)對膽堿脂肪酸皂具有高生物相容性的先驗(yàn)假設(shè)是否有效，筆者研究了鏈長為m=12～18的ChCm鹽的生物降解能力，并使用兩種不同的人類細(xì)胞系子宮頸癌細(xì)胞（HeLa）和角質(zhì)形成細(xì)胞（SK-Mel-28）進(jìn)行了體外細(xì)胞毒性分析。這項(xiàng)工作的主要目的是為了證明膽堿羧酸鹽表面活性劑對環(huán)境和最終用戶無害，為其在日常生活產(chǎn)品中的使用提供支持。

根據(jù)文獻(xiàn)，表面活性劑對HeLa測試通常顯示出較高的重現(xiàn)性，并且與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)具有良好的相關(guān)性。因此，它們被公認(rèn)為是以兔子為研究對象進(jìn)行眼刺激實(shí)驗(yàn)（Draize實(shí)驗(yàn)）的合理替代方法。選擇角化細(xì)胞系來檢查皮膚刺激能力。我們研究了烷基鏈長為m=8～16的膽堿脂肪酸鹽對這兩種細(xì)胞系的細(xì)胞毒性的影響。為了更好地與以前的研究進(jìn)行比較，我們通過在相同實(shí)驗(yàn)條件下測量脂肪酸鈉和脂肪酸鉀對這兩種細(xì)胞系的IC50值。此外，為了闡明毒性的潛在機(jī)理，即表面活性劑是否僅對細(xì)胞外膜具有非特異性破壞，或者表面活性劑是否可以滲透到細(xì)胞內(nèi)更具體地影響細(xì)胞功能，我們使用芘取代月桂酸鈉和月桂酸膽堿鹽進(jìn)行了細(xì)胞熒光顯微鏡分析。

值得一提的是，以前的研究主要集中在偶數(shù)脂肪酸皂的細(xì)胞毒性上，因?yàn)樗鼈冊诓溉閯游锛?xì)胞的天然脂肪酸儲庫中含量最高。在本研究中，根據(jù)結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系（SAR）對奇數(shù)碳同系物進(jìn)行了評估，以研究這些化合物是否顯示出輪廓作用或遵循假定的細(xì)胞毒性隨著疏水鏈長度的增加而增加的總體趨勢。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑和樣品準(zhǔn)備

按文獻(xiàn)的方法，合成膽堿月桂酸鹽（ChC12），膽堿肉豆蔻酸鹽（C h C 1 4），膽堿棕櫚酸鹽（ChC16）和膽堿硬脂酸鹽（ChC18），并通過兩次重結(jié)晶純化。辛酸鈉（≥99%），癸酸鈉（≥98%）和十二烷酸鈉（99%～100%）購自Sigma-Aldrich，并按原樣使用。辛酸（≥99%，Sigma），壬酸（≥97%，Sigma-Aldrich），癸酸（99%，Alfa Aesar），十一酸（99%，Aldrich），月桂酸（≥ 99%，Merck），十三烷酸（≥98%，Sigma）和十五烷酸（99%，Aldrich）。氫氧化鈉和氫氧化鉀用作滴定溶液（0.1 N和1 N（Merck））。從Taminco公司獲得氫氧化膽堿，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為46%的水溶液。為了防止膽堿的分解，將儲備溶液放在-18℃的氮?dú)庀卤芄獗４?。膽堿的準(zhǔn)確濃度通過用0.1 mol/L HCl（Merck）滴定3次來確定。所得到的肥皂以水溶液的形式存在，對于C11和更長的鏈長為1質(zhì)量分?jǐn)?shù)，對于C10為2質(zhì)量分?jǐn)?shù)，對于C8和C9均為5質(zhì)量分?jǐn)?shù)。為了更好地進(jìn)行比較并統(tǒng)一表示，圖3僅顯示了通過直接中和制備的表面活性劑的數(shù)據(jù)。

對于熒光顯微鏡，按原樣使用1-吡咯十二烷酸（≥98%，Sigma），然后用膽堿或氫氧化鈉中和，分別得到1-吡咯十二烷膽堿（ChPC12）和1-吡咯十二烷酸鈉（NaPC12）。在60～80℃時(shí)，取代的膽堿和月桂酸鈉不溶。因此，將它們與相應(yīng)的未官能化的脂肪酸皂以1∶2的摩爾比混合，從而在環(huán)境溫度下得到澄清的溶液。

1.2 生物降解力

按照OCDE 301F規(guī)范研究了m=2～18（偶數(shù)）ChCm鹽的生物降解性，這需要確定生物（BOC）和理論（TOC）耗氧量。乙酸鈉用作參考，使用已知的分子結(jié)構(gòu)，可以根據(jù)等式（1）計(jì)算TOC值（以每毫克產(chǎn)品中的氧氣毫克數(shù)計(jì)），它反映了化合物完全氧化所需的氧氣量。

BOC值是通過IBUK呼吸計(jì)確定的，呼吸計(jì)可檢測降解過程中的氧氣消耗量。在含有多種鹽（磷酸鈉和磷酸鉀；氯化銨，氯化鈣和氯化鐵；硫酸鎂）以及從當(dāng)?shù)貜U水處理廠收集的細(xì)菌培養(yǎng)基中，于20℃下進(jìn)行了28 d的實(shí)驗(yàn)。最后，按照以下方程式計(jì)算生物降解性值：

為了檢查肥皂對細(xì)菌可能產(chǎn)生的有害影響，研究了每種化合物的各種濃度。以下3個(gè)參數(shù)作為實(shí)驗(yàn)可靠性的標(biāo)準(zhǔn)：

（1）醋酸鈉的降解必須在14 d后達(dá)到60%以上的水平。在我們的實(shí)驗(yàn)中，這一比例為96.4%;

（2）礦物介質(zhì)必須在28 d之內(nèi)顯示低于60 mg/L的耗氧量。在我們的實(shí)驗(yàn)中，只有6 mg/L;

（3）28 d后，pH必須介于6和8.5之間，我們的每個(gè)測定都是如此。

1.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

通過MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑鎓）測定表面活性劑的細(xì)胞毒性，所用細(xì)胞為HeLa（子宮頸癌細(xì)胞，ATCC CCL17）和SK-Mel-28（角質(zhì)形成細(xì)胞，CLS 300337）。在這兩種情況下，使用由Mosmann引入并由Vlachy等修改的MTT分析程序。簡而言之，將細(xì)胞以每孔2.5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種在96孔板中，并與不同濃度的待測化合物一起培養(yǎng)，未處理的細(xì)胞用作陰性對照。與測試化合物在37℃下培養(yǎng)68 h后，將15 mL MTT溶液（5 mg/mL）添加到每個(gè)孔中。隨后培養(yǎng)4 h后，移去培養(yǎng)基，加入150 mL10%的SDS溶液，并將溶液過夜。然后，用酶標(biāo)儀在560 nm下測量光密度。

根據(jù)濃度-響應(yīng)曲線計(jì)算出每種物質(zhì)的IC50值（以mmol/mL為單位），該曲線是根據(jù)8種不同濃度生成的（有關(guān)詳細(xì)信息，請參見ESI）。IC50值與未處理的對照，被測化合物培養(yǎng)72 h后MTT降低50%的濃度。為獲得更好的可比性，同一天（一式3份）測定所有物質(zhì)的IC50值。在數(shù)周內(nèi)重復(fù)進(jìn)行3至5次實(shí)驗(yàn)（n=4～6），并記錄平均IC50值及其標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）。觀察到的最大（絕對）標(biāo)準(zhǔn)偏差約為15%。

通過單向方差分析和Posthoc Scheffe程序確定細(xì)胞毒性與測定的IC50值之間的統(tǒng)計(jì)差異和一致性。

1.4 熒光顯微法

將HeLa細(xì)胞以每培養(yǎng)皿1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種在m盤（35 mm，Ibidi GmbH）中，并培養(yǎng)過夜。對于顯微鏡分析，使用無酚的培養(yǎng)基。使用來自Zeiss（Hallbergmoos，德國）的CellObserver系統(tǒng)進(jìn)行成像，該系統(tǒng)包括計(jì)算機(jī)控制的倒置熒光顯微鏡（AxioObserver），具有AxioVision 4.7軟件和AxioCam HRm CCDCamera的全分辨率。 使用63×LCI Plan-Neouar物鏡和一組適合熒光的濾光片（HC 340/26，Q380 LP，HQ 420/40）采集圖像。

為了監(jiān)測所研究的肥皂的細(xì)胞攝取，將熒光ChPC12和ChC12或NaPC12和NaC12的混合物（均以1:2的摩爾比）添加到培養(yǎng)基中。對于ChPC12/ChC12使用的濃度和IC50值分別為81mmol/L和(115±2) μmol/L，對于NaC12/NaPC12使用的濃度和IC50值分別為102 μmol/L和(154±2) μmol/L。加入表面活性劑后立即拍攝相襯和熒光圖像，隨后在長達(dá)1 h的時(shí)間內(nèi)每10 min從同一皿中隨機(jī)選擇細(xì)胞進(jìn)行拍攝。我們注意到，在培養(yǎng)基中的背景熒光可以忽略不計(jì)。

2 結(jié)果討論

2.1 生物降解力

表面活性劑的生物降解性是很重要的性能，這說明了它們在環(huán)境中持續(xù)存在的能力。 根據(jù)REACH（化學(xué)品注冊、評估和授權(quán)）法規(guī)，所有新化學(xué)品都必須通過最終的生物降解測試才能進(jìn)入市場，因此，我們用乙酸鈉確定了從月桂酸到硬脂酸的膽堿脂肪酸皂的生物降解能力。

通常，就OCDE標(biāo)準(zhǔn)而言，如果在十天內(nèi)有機(jī)物從60%的水平被分解到10%，并且如果28 d后總體上至少分解了60%的有機(jī)物，則該有機(jī)物是可生物降解的。根據(jù)歐洲標(biāo)準(zhǔn)CE2004/648，如果表面活性劑在28 d后有60%被降解（即沒有10 d的窗口標(biāo)準(zhǔn)），則表面活性劑可以歸類為可生物降解的。圖2顯示了m=12～18（偶數(shù)）的ChCm皂的生物降解曲線隨時(shí)間的變化。顯然，所研究的化合物都在10 d之內(nèi)達(dá)到了后者的標(biāo)準(zhǔn)。此外，無論碳鏈長短，膽堿脂肪酸皂的生物降解均立即開始，這表明膽堿衍生物的潛在毒性對生物沒有抑制作用。

圖2 降解時(shí)間對月桂酸膽堿（□）、肉豆蔻酸酯（○）、棕櫚酸酯（△）和硬脂酸酯（◇）生物降解度的影響，以乙酸鈉（○）為標(biāo)準(zhǔn)

在OCDE指南中，建議以100 mg/L的濃度測試產(chǎn)品。如有必要，此后可以降低測試濃度。我們的結(jié)果為在50 mg/L和90 mg/L下進(jìn)行測試的平均值。每種化合物在兩種濃度下測試結(jié)果的差異非常?。ㄐ∮?%）。這證實(shí)了所研究的膽堿脂肪酸皂的毒性低。關(guān)于鏈長的影響，我們觀察到28 d后生物降解性的最終水平還在變化，范圍從ChC12的約100%到ChC16的超過85%再到ChC14和ChC18的約80%。然而，由于C14同系物打破了總體趨勢，因此無法建立生物降解性和疏水性之間的簡單關(guān)系。這種現(xiàn)象可能與性能參數(shù)（例如Krafft點(diǎn)）或明顯的聚集行為有關(guān)。實(shí)際上，在所研究的膽堿脂肪酸皂中，ChC18是唯一Krafft點(diǎn)高于20℃的化合物。無論如何，當(dāng)比較ChC12（82%）和NaC12（58%）5 d后的生物降解水平時(shí)，膽堿鹽的生物降解性明顯超過了其對應(yīng)的鈉鹽。

在有氧和厭氧的條件下，經(jīng)典肥皂已被廣泛研究，并被稱為易于生物降解，但它們?nèi)菀资艿剿捕鹊挠绊?，因?yàn)樾纬傻乃苄遭}鹽和鎂鹽很難降解。相對于堿性同系物而言，膽堿脂肪酸皂對二價(jià)陽離子的存在也非常敏感，因此可能也會表現(xiàn)出類似的行為。此外，膽堿離子本身不會對環(huán)境產(chǎn)生任何有害影響，因?yàn)樗梢员晃⑸锓纸?，在土壤中無法積累。

因此，所研究的膽堿脂肪酸皂都可以認(rèn)為是易于生物降解的，因?yàn)樗鼈円环矫娑纪ㄟ^了10 d的窗口標(biāo)準(zhǔn)，另一方面又在13 d內(nèi)降解了70%。這一發(fā)現(xiàn)與其他膽堿鹽（如中短鏈烷酸衍生物）的早期研究相吻合。

2.2 細(xì)胞毒性

表面活性劑良好的水溶性是進(jìn)行體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的必要條件。已知表面活性劑的Krafft溫度會隨著烷基鏈長的增加而升高，對于本研究中的膽堿脂肪酸皂，Krafft溫度會隨著陽離子的尺寸增加而降低。因此，在我們的研究中，烷基鏈的最大長度限制為鈉皂的m=12，鉀皂的m=13，膽堿皂的m=16。細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，膽堿脂肪酸皂、脂肪酸鈉和脂肪酸鉀對HeLa和SK-Mel-28細(xì)胞系的細(xì)胞毒性如圖3所示（以IC50值表示）。

對于這兩種細(xì)胞系，在毫摩爾范圍內(nèi)，ChCm表面活性劑的細(xì)胞毒性與鈉、鉀同系物的細(xì)胞毒性基本相當(dāng)（除了m=15和m=16）。表明膽堿脂肪酸皂在所選條件下具有低細(xì)胞毒性。

圖3 （a）HeLa和（b）SK-Mel-28細(xì)胞培養(yǎng)72 h后獲得的羧酸鹽的IC50值與烷基鏈長m的關(guān)系

對具有羧酸根基團(tuán)和各種抗衡離子（包括堿金屬和季銨離子）的陰離子表面活性劑的細(xì)胞毒性測試指出，陽離子越大，毒性越低。這種趨勢可以用離子對的形成來解釋：可極化的較大離子比較小的堿金屬離子更易與羧酸頭基結(jié)合，且離子對的形成可以降低咪唑鎓鹽和吡啶鎓鹽離子液體的毒性。Petkovic等檢測到膽堿離子液體的毒性比鈉離子液體略低，也是相同的原因。與先前的研究相比，我們無法在實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證陽離子特異性。這可能是因?yàn)樗玫募?xì)胞培養(yǎng)基含有多種鹽（例如NaCl或CaCl2），不會出現(xiàn)明顯的離子效應(yīng)。但是，我們的結(jié)果對陽離子的非特異性是合理的，因?yàn)橹辽僭谙嚓P(guān)的濃度范圍內(nèi)，鈉、鉀和膽堿均未表現(xiàn)出內(nèi)在的毒性作用。因此，膽堿脂肪酸皂的毒性主要源自陰離子。

根據(jù)SAR概念，預(yù)期細(xì)胞毒性與疏水性呈線性關(guān)系。這種趨勢在許多離子液體中都可以觀察到，尤其是鏈長為m=10～12時(shí)。疏水性通常由辛醇-水系數(shù)（P）表示，對于表面活性劑可以用臨界膠束濃度（CMC）表示。由于表面活性劑的CMC隨著烷基鏈長度的增加而線性降低，因此IC50值與m的關(guān)系圖上應(yīng)該顯示出基本相同的變化。然而，對m=8～16的奇數(shù)碳和偶數(shù)碳脂肪酸膽堿鹽的細(xì)胞毒性的詳細(xì)評估表明，對于兩種細(xì)胞系，文獻(xiàn)報(bào)道的線性趨勢在研究的整個(gè)鏈長范圍內(nèi)均無效（參見圖3）。使用方差分析程序進(jìn)行的數(shù)據(jù)分析表明，對于m=11～14所獲得的值之間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著差異。因此，我們觀察到m=11到m=14之間的趨勢是平穩(wěn)的，而不是線性趨勢。反過來，對于m≤11的皂，IC50值可以通過線性關(guān)系很好地描述，在膽堿皂和HeLa的情況下細(xì)胞的log IC50（mmol/L）＝（2.1±0.2）–（0.24±0.02）m（R=0.995）。有人可能會說，奇數(shù)碳脂肪酸皂偏離了線性趨勢，但它們在脂肪酸的生物合成中并不常見，因此對生物學(xué)功能的重要性不如偶數(shù)碳脂肪酸皂。同樣，經(jīng)常報(bào)道的奇數(shù)碳和偶數(shù)碳脂肪酸在物理化學(xué)性質(zhì)上（如熔點(diǎn)或krafft點(diǎn)）的鋸齒狀行為，也無法使IC50值隨烷基鏈長的變化趨勢合理化。

據(jù)我們所知，迄今尚未報(bào)道具有不同鏈長的表面活性劑的細(xì)胞毒性達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)。一般而言，早期的肥皂和陰離子表面活性劑研究（不幸的是僅在偶數(shù)鏈上進(jìn)行）確定了m=12～14時(shí)細(xì)胞毒性最大，這在文獻(xiàn)中通常被稱為截止效應(yīng)，為解釋這一現(xiàn)象，提出了幾個(gè)論點(diǎn)，如水溶性不足（即實(shí)際測試濃度偏離標(biāo)稱濃度）或動力學(xué)方面（例如，在高分子量化合物的情況下，由于空間效應(yīng)而減速吸收）。對于表面活性劑在中鏈長度處發(fā)現(xiàn)的最大刺激性和毒性還歸因于兩個(gè)因素：一方面，隨著烷基鏈長度的增加，CMC以及可用單體的極限濃度會降低；而另一方面，油水分配系數(shù)和疏水性同時(shí)增加。

在本研究中，由于我們只研究了Krafft點(diǎn)為室溫或更低溫度的表面活性劑，因此基本可以排除水溶性不足的影響?？紤]到長鏈脂肪酸鈉在40℃以下基本不溶于水，并且無m=11的研究數(shù)據(jù)，故許多文獻(xiàn)將鈉皂在m=12時(shí)表現(xiàn)出的最大的毒性歸結(jié)于有限的水溶性可能也是合理的。相比之下，膽堿肥皂的水溶性增加，使我們能夠研究碳鏈更長的脂肪酸皂的細(xì)胞毒性。因此，在對脂肪酸膽堿皂進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測時(shí)，不太可能出現(xiàn)簡單的截止效應(yīng)，反而是經(jīng)過一個(gè)平臺后，細(xì)胞毒性隨著烴鏈長度的增加而進(jìn)一步增加。同樣，由于所有的測試濃度均低于各自的CMC，IC50值的測定并不受膠束形成的影響。此外，表面活性劑的毒性主要?dú)w因于單體而不是聚集體。Roberts等人的定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系（QSAR）研究，表明了化合物是否為表面活性劑與其毒性無關(guān)，相反疏水性似乎是影響毒性的主要因素。

通常認(rèn)為陰離子表面活性劑具有極性麻醉劑的作用。Roberts等建議根據(jù)溶質(zhì)在水和細(xì)胞膜之間的分配方式來區(qū)分普通和極性麻醉劑的機(jī)理。他們提出，諸如酒精之類的普通麻醉劑通過在細(xì)胞膜內(nèi)的三維分配來起作用，這意味著它們能夠在雙層膜的疏水內(nèi)核中向各個(gè)方向移動。反過來，極性麻醉劑僅能憑借溶質(zhì)的極性基團(tuán)與膜表面的磷脂酰膽堿頭基的結(jié)合進(jìn)行二維分配。仔細(xì)觀察膽堿脂肪酸皂的劑量反應(yīng)曲線，可以發(fā)現(xiàn)不同m值的曲線變化存在差異：碳鏈較短時(shí)，細(xì)胞活力隨著表面活性劑濃度的減少而逐漸增加，碳鏈較長時(shí)它們突然升高。這表明，與m≥12的鹽相比，m=11的脂肪酸膽堿皂的作用機(jī)理不同。一種可能的情況是，如Roberts等人所述的，較短鏈的衍生物在3D分區(qū)的框架中起一般麻醉品的作用，而它們的較長鏈同系物被膜更有效地結(jié)合，因此可以視為2D分區(qū)溶質(zhì)。需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來支持這一假設(shè)，并闡明這些脂肪酸系統(tǒng)中烷基鏈長度變化時(shí)觀察到的IC50值不常見的變化趨勢。

2.3 通過熒光顯微鏡監(jiān)測膽堿和鈉皂的細(xì)胞攝取和在細(xì)胞內(nèi)的分布

為了大致了解膽堿脂肪酸鹽和鈉皂的細(xì)胞毒性，將HeLa細(xì)胞與芘取代的月桂酸鈉或月桂酸膽堿及相應(yīng)的非功能化脂肪酸鹽以1:2摩爾比混合培養(yǎng)，其濃度略低于其各自的IC50。隨后，通過監(jiān)測熒光隨時(shí)間的變化來跟蹤肥皂在這種細(xì)胞內(nèi)的行為。顯微照片如圖4所示。

圖4 添加表面活性劑后，將HeLa細(xì)胞與ChPC12 / ChC12的混合物（摩爾比為1:2）一起培養(yǎng)的相襯（左）和熒光（右）圖像

獲得的結(jié)果表明，肥皂是細(xì)胞膜的非特異性破壞劑。根據(jù)芘的熒光，我們觀察到表面活性劑實(shí)際上能夠穿透細(xì)胞膜并在細(xì)胞內(nèi)部積聚（參見圖4）。在這方面，沒有發(fā)現(xiàn)膽堿和鈉鹽之間的明顯差異，與它們的IC50值趨勢一致。細(xì)胞攝取非常迅速：培養(yǎng)10 min后，在整個(gè)細(xì)胞中都可以看到廣泛的熒光，然后熒光強(qiáng)度逐漸增加，直到大約30 min后達(dá)到某種飽和度。正如陰離子表面活性劑所預(yù)期的那樣，在檢查期間細(xì)胞核不受影響。

最值得注意的是，除了細(xì)胞內(nèi)均勻的熒光外，我們還可以識別細(xì)胞內(nèi)的熒光聚集體，這可能代表了所謂的“細(xì)胞質(zhì)脂滴”（CLD）。CLD由中性脂質(zhì)核心和周圍的磷脂單層組成，幾乎在每種哺乳動物細(xì)胞中都可以找到。它們由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成，并通過摻入三?；视投L。在我們的實(shí)驗(yàn)中觀察到的細(xì)胞熒光非常類似于CLD的典型現(xiàn)象。由于已知CLD是多余脂質(zhì)的沉積物，并且就緩沖細(xì)胞培養(yǎng)基的中性pH而言，肥皂可能以質(zhì)子化脂肪酸的形式被吸收到細(xì)胞中并摻入CLD中。此外，很可能會發(fā)生CLD中熒光的積累。但是，需要更多數(shù)據(jù)來了解細(xì)胞吸收的分子的確切定位。

3 結(jié)論

在這項(xiàng)工作中，我們研究了膽堿脂肪酸鹽的生物相容性。膽堿脂肪酸鹽是一類新的表面活性劑，以前已經(jīng)證明其比經(jīng)典的堿皂類似物具有更大的優(yōu)勢，主要是長鏈衍生物在環(huán)境溫度下的溶解度更大，這對于洗滌過程尤為重要。我們的研究表明，根據(jù)歐洲規(guī)范，對于m=12～18的鏈長膽堿脂肪酸鹽，考慮到其組成分子具有生物起源并存在于許多活生物體中（至少是偶數(shù)鏈長）這些表面活性劑可以認(rèn)為是易于生物降解的。對人體細(xì)胞系的細(xì)胞毒性測試還證明，膽堿脂肪酸皂的危害性不大于其對應(yīng)的鈉皂和鉀皂，而膽堿脂肪酸皂的確在各種配方具有廣泛的應(yīng)用潛力。因此，這些結(jié)果為膽堿表面活性劑在客戶產(chǎn)品中的應(yīng)用提供了實(shí)質(zhì)性支持，這與一直存在的禁令相反。

通過對不同碳鏈長度的膽堿脂肪酸鹽細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，m≤11時(shí)，隨著疏水性的增加，毒性或多或少呈線性增加，但是與許多先前研究的結(jié)果不同，這種簡單的線性趨勢不會在較長的鏈長時(shí)繼續(xù)下去；當(dāng)m=11～14時(shí)，疏水鏈長與細(xì)胞毒性的關(guān)系尚不清楚，只能通過研究奇數(shù)碳脂肪酸來解決。這一意想不到的特征在統(tǒng)計(jì)上得到了驗(yàn)證，在大量的分析中，被證明是獨(dú)立于陽離子和細(xì)胞系的。實(shí)際上，無論使用HeLa還是SK-Mel-28細(xì)胞，在膽堿、鈉和鉀的羧酸鹽中測定的IC50值都非常相似，或者在實(shí)驗(yàn)誤差范圍內(nèi)幾乎可以認(rèn)為是相同的。因此，沒有觀察到陽離子選擇性，并且可以得出結(jié)論，毒性主要來自陰離子。一個(gè)簡單的截止效應(yīng)不能解釋我們實(shí)驗(yàn)中追蹤到的IC50值的異常變化，因?yàn)樵趍=11～14的平臺期之后，細(xì)胞毒性隨著鏈長的增加而進(jìn)一步增加（m=15～16）。我們認(rèn)為m=11的膽堿脂肪酸鹽通過不同于m≥12的同系物的細(xì)胞毒性機(jī)制起作用。具有較長烷基鏈的表面活性劑最有可能更有效地結(jié)合到膜的雙層中。通過熒光顯微鏡研究HeLa細(xì)胞攝取芘取代的膽堿鹽和十二烷酸鈉鹽，可以進(jìn)一步了解這些化合物在體內(nèi)的行為。相應(yīng)的數(shù)據(jù)表明，表面活性劑不會簡單地以非特異性方式破壞細(xì)胞外膜，而是以相對較快的速度滲透到細(xì)胞內(nèi)部。

綜上所述，我們的研究結(jié)果證明了膽堿羧酸鹽成為有前途的綠色表面活性劑的潛力。當(dāng)然，這還需要進(jìn)行其他研究，例如水生生物毒性的測定，以評估把膽堿作為季銨離子的簡單分類是否合理，并證明其目前作為化妝品配方中的成分是合理的。此外，還要評估這些膽堿脂肪酸皂的抗菌潛力。無論如何，目前的工作已經(jīng)邁出了第一步，但還有重要的一步，促進(jìn)膽堿脂肪酸皂在實(shí)際客戶產(chǎn)品中的應(yīng)用。在不久的將來，這些高效表面活性劑的使用將成為可能。

程書钘譯自The Royal Society of Chemistry RSC Adv., 2013, 3。