氧化樂果降解菌ZZY-C13-1-9 的篩選、鑒定及降解能力

陳 銳，瞿 佳，門 欣，鄧 媛，孫曉宇，趙玲俠，沈衛(wèi)榮

（1.陜西省微生物研究所微生物菌種資源研究中心，陜西 西安 710043；2.陜西省科學(xué)院秦嶺天然產(chǎn)物工程中心，陜西 西安 710043）

0 引言

【研究意義】氧化樂果是常用的一類有機(jī)磷殺蟲劑，其作用原理是通過抑制乙酰膽堿酶（AChE）活性，導(dǎo)致神經(jīng)損傷，從而殺死目標(biāo)物[1]。殘留于土壤中的氧化樂果一方面對(duì)自然環(huán)境造成破壞，研究表明氧化樂果在土壤中顯著抑制土壤脲酶活性[2]，對(duì)自然環(huán)境中的蜜蜂、斑馬魚、水藻等有較高毒性[3-5]；另一方面對(duì)人類健康產(chǎn)生威脅，據(jù)研究表明有機(jī)磷酸酯誘導(dǎo)遲發(fā)性多發(fā)性神經(jīng)病[6]，誘導(dǎo)咽癌細(xì)胞增殖[7]，具有發(fā)育毒性和神經(jīng)毒性[8]，成人及兒童暴露于有機(jī)磷的威脅不容樂觀[9]?？焖俳档屯寥罋埩舻难趸瘶饭娇筛纳仆寥蕾|(zhì)量，保護(hù)環(huán)境及人類健康?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】土壤中殘留的有機(jī)污染物一般采用物理、化學(xué)及生物等方法進(jìn)行處理，已有研究表明微生物具有降解有機(jī)磷類農(nóng)藥的潛能[10]。目前報(bào)道的對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥具有降解能力的微生物有很多[11]，已分離出降解馬拉硫磷的假單胞菌（Pseudomonassp.）和綠色木霉（Trichoderma viride）[12]，降解甲基對(duì)硫磷、三唑磷的斯氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）[13]，降解草甘膦的蒼白桿菌（Ochrobactrumsp.）和無色桿菌（Achromobactersp.）[14]，降解久效磷的鞘氨醇單胞菌（Sphingobiumsp.）[15]等。根據(jù)我國微生物肥料生物安全通用技術(shù)準(zhǔn)則的要求（NY 1109-2006），前述部分菌株可能為條件致病菌，需經(jīng)過急毒或致病性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其安全性才可應(yīng)用，例如綠色木霉或假單胞屬。另外一部分菌株雖對(duì)氧化樂果有降解能力，但降解水平較低，例如：短波單胞菌屬（Brevundimonassp.）在土壤中可降解1 mg·kg-1的氧化樂果，降解率87.75%[16]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)于高濃度氧化樂果的生物降解研究報(bào)道不多，土壤試驗(yàn)及田間試驗(yàn)報(bào)道則更少，單一微生物是否可加速棚室土壤殘留氧化樂果降解有待進(jìn)一步驗(yàn)證。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究擬通過高濃度的氧化樂果富集篩選方法從土壤中篩選獲得微生物菌株，該菌株不僅在搖瓶中對(duì)氧化樂果有較好的降解效果，在土壤中亦能發(fā)揮迅速降低氧化樂果含量的功能，對(duì)加快土壤中氧化樂果降解具有一定應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 土壤樣品來源于陜西省渭南、周至棗園及秦嶺田峪等地，共收集土壤樣本24 份（表1）。

1.1.2 無機(jī)鹽培養(yǎng)基 硫酸銨 0.4 g，硝酸銨 1.2 g，磷酸二氫鉀 0.5 g，磷酸氫二鉀1.5 g，硫酸鎂 0.5 g，氯化鈉 0.5 g，pH 7.0，定容至1 L。121 ℃ 滅菌20 min。

1.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基 酵母浸粉2.5 g、蛋白胨5 g、甘油2.5 mL、NaCl 2.5 g、磷酸二氫鉀2.5 g，加水至500 mL。

1.1.4 有機(jī)磷測(cè)試試劑 （1）4 % NaOH 溶液：4 g NaOH 加去離子水定容至100 mL。（2）3.75 mol·L-1硫酸溶液：100 mL 容量瓶內(nèi)加去離子水80 mL，慢慢滴加20 mL 濃硫酸至100 mL。（3）2.769 %鉬酸銨溶液：準(zhǔn)確稱取2.769 g 鉬酸銨，加去離子水定容至100 mL。（4）0.2 %氯化亞錫：0.2 g 加去離子水定容至100 mL。

1.2 方法

1.2.1 氧化樂果降解菌的分離 在100 mL 無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入2.5 mL 氧化樂果（質(zhì)量濃度1 000 mg·L-1，沙隆達(dá)，40%乳油）混勻。加入土樣1 g，30 ℃ 180 r·min-1搖床培養(yǎng)7 d。取1 mL 轉(zhuǎn)接至100 mL 無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基（含氧化樂果1 000 mg·L-1），30 ℃ 180 r·min-1繼續(xù)培養(yǎng)7 d，連續(xù)3 次[17]。取發(fā)酵培養(yǎng)液1 mL，梯度稀釋，涂布于含氧化樂果（1 000 mg·L-1）的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)，待菌落形成。選取單菌落進(jìn)行營養(yǎng)肉湯平板劃線純化3 次，甘油管-80℃超低溫保藏。

1.2.2 菌株降解能力的初步測(cè)定 將菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30 ℃、 180 r·min-1震蕩培養(yǎng)24 h。100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基（含氧化樂果 400 mg·L-1），接入 菌 液1 mL，30 ℃、180 r·min-1震 蕩 培 養(yǎng)240 h。3 次重復(fù)，設(shè)無菌培養(yǎng)液作為空白對(duì)照。以鉬酸銨顯色法進(jìn)行氧化樂果含量的測(cè)定[18]。配制不同濃度標(biāo)準(zhǔn)試劑（沈陽化工研究院，含量大于95%），制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取發(fā)酵液100 μL 至帶刻度試管，加入4%NaOH 溶液1 mL，振搖1 min，然后依次加入3.75 mol ·L-1的硫酸溶液280 μL，2.769%鉬酸銨溶液200 μL，0.2%的氯化亞錫溶液150 μL，定容至2.5 mL，混勻。放置5 min，各取100 μL 至96 孔板，710 nm下檢測(cè)。

1.2.3 降解菌的形態(tài)及種屬鑒定 取菌株在營養(yǎng)肉湯平板上劃線，30 ℃培養(yǎng)48 h，觀察其菌落形態(tài)，取菌體涂片進(jìn)行革蘭氏染色鑒定。

取培養(yǎng)的單菌落，使用Biolog 鑒定系統(tǒng)，MicroPlates 微孔板：Biolog GEN III MicroPlates（Biolog Catalog No.1030），接種液：IF-A（Biolog Catalog No.72401），試驗(yàn)方法參照說明書，對(duì)菌株進(jìn)行種屬鑒定。

1.2.4 降解菌的16S rDNA 序列鑒定 取菌液2 mL，離心取菌體，提取菌株的基因組（TIANGEN DP302）。選擇保守區(qū)M13 序列，引物采用27F5'-AGAGTTTG ATCMTGGCTCAG- 3′、1492R5′-TACGGYTACCTTG TTACGACTT-3′，PCR 擴(kuò)增16S rDNA，測(cè)序（奧科）。測(cè)序結(jié)果利用Blast 軟件在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，用系統(tǒng)發(fā)育樹軟件Clustal X 及MEGA 4 構(gòu)建分類系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 土壤樣本信息Table 1 Information on soil sample

1.2.5 HPLC 法測(cè)定氧化樂果殘留量 吸取10 μL 氧化樂果標(biāo)準(zhǔn)品，用水∶甲醇=4∶1（v/v）稀釋成500、400、200、100、50、10 mg·L-1等梯度濃度，各5 mL，HPLC 測(cè)定，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取氧化樂果乳油1 mL 加入100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中（質(zhì)量濃度約為400 mg·L-1），接入菌液1 mL，30 ℃、180 r·min-1搖瓶培養(yǎng)。0 h、240 h 分別取樣測(cè)定氧化樂果含量。取8 mL 發(fā)酵液，加入2 mL 甲醇，離心去除菌體，待HPLC 測(cè)定[19]。HPLC 檢測(cè)：色譜柱依利特C18柱，粒徑5 μm，檢測(cè)波長220 nm，流動(dòng)相水∶甲醇=4∶1，流速1.0 mL·min-1，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.6 降解菌株對(duì)其他有機(jī)磷農(nóng)藥耐藥能力測(cè)定 在10 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的敵敵畏（77.5% 乳油 沙隆達(dá)）、敵百蟲（90% 原藥 沙隆達(dá)）（質(zhì)量濃度為1 000、500、200 mg·L-1），接入菌 液100 μL，30 ℃、180 r·min-1培 養(yǎng)48 h 后 測(cè) 定OD600nm，觀察菌株的生長受農(nóng)藥抑制情況。

1.2.7 菌劑制備及土壤室內(nèi)驗(yàn)證試驗(yàn) 將降解菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行菌體發(fā)酵，30 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)48 h，離心收集菌體。按照菌體∶甘油的體積比1∶1 的比例加入甘油，并攪拌混合均勻；再按照菌體∶活性炭∶高嶺土體積比2∶3∶3 的比例加入過300 目篩的活性炭和高嶺土，攪拌混合均勻，獲得農(nóng)藥氧化樂果降解微生物菌劑。在室內(nèi)進(jìn)行土壤降解試驗(yàn)。取4 kg 無菌營養(yǎng)土，人工添加氧化樂果，使氧化樂果含量達(dá)到200 mg·kg-1，再加入菌劑20 g 攪拌均勻，保持室內(nèi)溫度25～34 ℃，定期輕翻土壤、噴施補(bǔ)充水分，保持土壤濕度25%～30%，45 d 后測(cè)定土壤氧化樂果殘留量。準(zhǔn)確稱取土壤20 g，加無水硫酸鈉研磨至干粉狀后，移置300 mL 具塞錐形瓶中, 加入60 mL 二氯甲烷浸泡6～8 h，過濾，再次加入二氯甲烷，萃取3 次[20]。合并萃取液，60 ℃水浴旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)至干，加入甲醇∶水（1∶4）溶解，定容至20 mL，HPLC 測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化樂果降解菌的分離

通過富集培養(yǎng)篩選從周至棗園土壤中分離獲得1 株細(xì)菌，該菌株可在無機(jī)鹽（含氧化樂果1 000 mg·L-1）平板上正常生長，經(jīng)數(shù)次純化獲得單一純培養(yǎng)菌株，將該菌命名為ZZY-C13-1-9。

2.2 ZZY-C13-1-9 降解能力初步測(cè)定

240 h 后取發(fā)酵液100 μL，鉬酸銨顯色，測(cè)定OD710nm。與空白對(duì)照相比，ZZY-C13-1-9 顯著降低了氧化樂果在發(fā)酵液中的含量，240 h 發(fā)酵液中殘留量為14%，空白對(duì)照為92%，具有顯著差異（圖1，P＜0.01），ZZY-C13-1-9 可有效降解氧化樂果。為進(jìn)一步驗(yàn)證該菌株的降解能力需通過其他更精準(zhǔn)的方法進(jìn)行檢測(cè)。

圖1 氧化樂果殘留含量Fig.1 Omethoate residue in fermentation broth

2.3 降解菌ZZY-C13-1-9 形態(tài)鑒定

鏡檢ZZY-C13-1-9 為直的革蘭氏陰性桿菌，不產(chǎn)生芽孢。菌落形態(tài)，光滑，圓形，微微凸起，表面濕潤，半透明，直徑1～2 mm（圖2）。

圖2 ZZY-C13-1-9 菌株形態(tài)鑒定Fig.2 Morphology of ZZY-C13-1-9

該菌可利用D-甘露醇、D-阿拉伯醇、肌醇、D-半乳糖、D-葡萄糖、甘油、肌醇、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-組胺、L-乳酸、檸檬酸、L-焦谷氨酸和L-絲氨酸，不分解利用蔗糖、糊精、麥芽糖、乳糖、明膠、甲酸。耐受林肯霉素、萬古霉素、利福平等抗生素。過氧化氫酶陽性和氧化酶陰性。參考伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)，初步鑒定該菌為嗜松香假單胞菌（Pseudomonas abietaniphila）。

2.4 降解菌ZZY-C13-1-9 的16S rDNA 序列鑒定

將降解菌16S rDNA 基因序列擴(kuò)增測(cè)序，經(jīng)GenBank 數(shù)據(jù)庫比對(duì)。選取DSM、ATCC、BCRC 等庫藏標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸序列作為參考，用系統(tǒng)發(fā)育樹軟件Clustal X 及MEGA 4 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示該菌為嗜松香假單胞菌（Pseudomonas abietaniphila）。將該序列提交Genbank，登錄號(hào)為：MN 709 129。

2.5 降解菌ZZY-C13-1-9 對(duì)氧化樂果的降解率測(cè)定

不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)HPLC 測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=1 915.3x+446.3，R2=0.998 2，曲線適用范圍為10～500 mg·L-1。取發(fā)酵液8 mL 加 入2 mL 甲 醇 助溶，去除菌體后經(jīng)HPLC 法測(cè)定，搖瓶發(fā)酵240 h后氧化樂果殘留量如圖4 所示。ZZY-C13-1-9 接入發(fā)酵培養(yǎng)基（含氧化樂果400 mg·L-1），30 ℃、180 r·min-1搖瓶培養(yǎng)240 h 后，發(fā)酵液中氧化樂果殘留量為31.5 mg·L-1，殘留量約7.7%，空白對(duì)照發(fā)酵240 h 后氧化樂果含量為336 mg·L-1，約為85.0%，差異極顯著（t-test，P=0.003 9）。

2.6 假單胞菌ZZY-C13-1-9 對(duì)其他有機(jī)磷農(nóng)藥耐受測(cè)定

圖3 ZZY-C13-1-9 與模式菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of ZZY-C13-1-9

圖4 氧化樂果殘留量Fig.4 Quantity of omethoate residues

有文獻(xiàn)表明對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥有降解能力的微生物對(duì)其他有機(jī)磷農(nóng)藥也具有一定的降解能力[21]。為了驗(yàn)證嗜松香假單胞菌ZZY-C13-1-9 對(duì)其他有機(jī)磷農(nóng)藥的耐受能力，將不同濃度的敵百蟲或敵敵畏加入10 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基試管，30 ℃、180 r·min-1發(fā)酵48 h后測(cè)定OD600nm。其結(jié)果表明，假單胞菌 ZZY-C13-1-9 不但可耐受其他高濃度有機(jī)磷農(nóng)藥（表2），敵敵畏還可能刺激該菌株的生長。對(duì)其他有機(jī)磷是否具降解能力待進(jìn)一步檢測(cè)驗(yàn)證。

2.7 菌劑制備及土壤室內(nèi)試驗(yàn)

降解菌ZZY-C13-1-9 發(fā)酵后離心與甘油、活性炭、高嶺土復(fù)配后形成菌劑。所使用的試驗(yàn)土壤pH 為6.4±0.4，含鹽量（0.91±0.24）g·kg-1，總 磷2.44 g·kg-1，總鉀 21.10 g·kg-1，總碳 28.00 g·kg-1，含水量25%～30%。土壤室內(nèi)試驗(yàn)中依照土壤重量的5‰施用菌劑，保持室內(nèi)溫度25～34 ℃，保持土壤相當(dāng)?shù)臐穸燃八缮⒍龋ㄆ谶M(jìn)行補(bǔ)水及翻動(dòng)。45 d后取土壤樣本進(jìn)行萃取，HPLC 法測(cè)定，土壤中約213 mg·L-1的氧化樂果被降解至87.0 mg·L-1，降解率達(dá)59.2%，空白對(duì)照土壤為169.58 mg·L-1，自然降解率為24.33%（表3），具有極顯著差異（t-test，P=0.016）。

表2 ZZY-C13-1-9 對(duì)其他有機(jī)磷農(nóng)藥的耐受Table 2 Tolerance of ZZY-C13-1-9 to organophosphorus pesticides

表3 土壤室內(nèi)試驗(yàn)氧化樂果殘留量及降解率（t-test，P=0.016）Table 3 Residues and degradation rate of omethoate in laboratory soil (t-test, P=0.016)

3 討論與結(jié)論

環(huán)境污染是生態(tài)環(huán)境及人類健康面臨的重要威脅，農(nóng)藥和化學(xué)污染物、重金屬是最為主要的環(huán)境污染因素[22]。一方面農(nóng)藥使用控制了植物病害，提高作物產(chǎn)量，促進(jìn)了經(jīng)濟(jì)發(fā)展，另一方面過量使用的農(nóng)藥又引起了生態(tài)環(huán)境問題[23]。殘留的農(nóng)藥通過各種途徑進(jìn)入環(huán)境，引起了生態(tài)改變[24-25]，造成人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病[26]、引發(fā)遺傳癌變[27]或腸道微生物菌群改變等問題[28]。微生物法降解土壤殘留農(nóng)藥對(duì)于恢復(fù)生態(tài)環(huán)境、降低食品安全風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義[29]。微生物可將復(fù)雜有機(jī)分子最終分解成為水和CO2，利用微生物增殖速度快的特點(diǎn)，在短時(shí)內(nèi)快速降低土壤中農(nóng)藥殘留的水平，使土壤恢復(fù)健康狀態(tài)[30]，并且該方法經(jīng)濟(jì)，沒有二次污染[31]。

關(guān)于氧化樂果的生物降解研究報(bào)道并不太多，M Chun 等[32]報(bào)道曲霉（Aspergillus spp.）菌株F-1 可將2 000 mg·L-1的氧化樂果在8 d 內(nèi)降解90%。Li 等[33]報(bào)道植物乳桿菌菌株（Lactobacillus plantarum）P9 可將0.5 mg·L-1的氧化樂果在7 d 內(nèi)降解56%。在本研究中除嗜松香假單胞菌ZZY-C13-1-9 以外也獲得無色桿菌（Achromobactersp.）、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）、成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）、蒼白桿菌（Ochrobactrum sp.）等菌株對(duì)氧化樂果也具有一定的降解性能。但具有條件致病性的菌株如蒼白桿菌（Ochrobactrumsp.）、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）等不利于應(yīng)用型研究的開展。本研究篩選獲得的微生物菌株ZZY-C13-1-9，在含1 000 mg·L-1的氧化樂果無機(jī)鹽培養(yǎng)基中正常生長。經(jīng)鑒定確定該菌為嗜松香假單胞菌（Pseudomonas abietaniphila）。經(jīng)HPLC 證實(shí)，在含氧化樂果400 mg·L-1發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r·min-1搖瓶培養(yǎng)240 h，氧化樂果的降解率達(dá)92.3%，該菌株無生物毒性，非條件致病，適于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。

顧欣等[16]報(bào)道短波單胞菌（Brevundimonassp.）菌株A1A18 在田間試驗(yàn)中可將氧化樂果（1 mg·kg-1）在7 d 內(nèi)降低86.19%。本研究獲得的假單胞菌ZZYC13-1-9 經(jīng)土壤室內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證有效，土壤室內(nèi)試驗(yàn)證明：土壤水分含量保持25%～30%，室內(nèi)溫度25～34 ℃嗜松香假單胞菌ZZY C13-1-9 在45 d 后可將土壤中200 mg·L-1的氧化樂果降解59.2%。但其代謝途徑及盆栽、田間試驗(yàn)則需進(jìn)一步進(jìn)行研究。并且假單胞菌ZZY-C13-1-9 可在其他兩種有機(jī)磷農(nóng)藥中正常生長，具有降解其他有機(jī)磷農(nóng)藥的潛能，對(duì)其他農(nóng)藥的降解效果亦待進(jìn)一步驗(yàn)證。