沙門菌噬菌體抗性菌的篩選鑒定及致病力研究

馬曉娟 秦晏捃

內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司 內(nèi)蒙古呼和浩特 010021

沙門菌是一種腸道致病菌，人體感染后可出現(xiàn)明顯的腹瀉表現(xiàn)，也是引起食物中毒的主要病原菌之一。當前研究顯示，常見的雞蛋、蛋制品、豬肉、奶酪等均存一定的的沙門菌感染問題[1]。隨著抗生素藥物的不合理使用，耐藥菌問題日益嚴重，并得到了眾多學者的關注，噬菌體較抗生素在細菌性感染疾病治療與預防方面更具有優(yōu)勢，噬菌體作為一種微生物，實際在感染性疾病治療與預防方面也可能出現(xiàn)抗性問題[2]。對此，本文通過沙門菌噬菌體抗性菌的篩選鑒定及致病力研究，便于為噬菌體抗性問題以及其安全使用提供依據(jù)，現(xiàn)就相關內(nèi)容分析如下。

1 材料與方法

1.1 材料和設備

腸炎沙門菌標準菌株，ATCC13076，噬菌體PA13076。雌雄小鼠若干，雌雄各占一半，體重：20-22g，5 周齡ICR 小鼠，小鼠需要提前進行1w 飼養(yǎng)，適應后開展攻毒實驗。保存在液氮罐中的小鼠腸道上皮細胞（MODE-K）。試劑：LB 培養(yǎng)基，瓊脂糖、瓊脂粉、胎牛血清、DEDM 細菌培養(yǎng)液、毒力島基因、腸毒素等。主要儀器有離心機、生物安全柜、恒溫振蕩器、凝膠成像分析儀等。

1.2 方法

對無誘變條件下形成的沙門菌噬菌體抗性菌通過次級感染法予以篩查。

于LB 瓊脂平板對沙門菌ATCC13076 進行劃線，37℃，連續(xù)培養(yǎng)24h，5mlLB 液體培養(yǎng)基接種單菌落，振蕩培養(yǎng)過夜，37℃，2000r/min，按照1:100 接種到新鮮LB 培養(yǎng)基中，使其OD600=0．5，感染復數(shù)（MOI）=1．0 時，將噬菌體PA13076 接入，37℃培養(yǎng)，培養(yǎng)約5h，保證培養(yǎng)液完全裂解，37℃，培養(yǎng)24h。LB 瓊脂平板均勻涂抹100μL 裂解液，37℃，培養(yǎng)24h，LB 液體培養(yǎng)基接種單菌落，連續(xù)進行3 次劃線，對細菌純化處理，得到噬菌體抗性菌株。

沙門菌噬菌體抗性菌鑒定：通過新鮮的ATCC13076 與噬菌體抗性菌液完成點樣實驗，并依次完成吸附率測定、遺傳穩(wěn)定性、抗性菌與宿主菌生長曲線分析、毒力基因檢測，然后實施小鼠抗性菌半數(shù)致死量（LD50）測定，細胞粘附力測定等。所有操作均由實驗室專業(yè)人員按照相關操作標準完成。

2 結(jié)果

初步篩查后獲得10 株PA13076 裂解抗性菌，通過遺傳穩(wěn)定性分析，噬菌體接入并實施連續(xù)培養(yǎng)，只有R3 對沙門菌噬菌體有抗性。R3 生長良好，為革蘭氏陰性桿菌。噬菌體能夠?qū)ι抽T菌裂解，但是對R3 無作用。宿主菌生長速度略大于噬菌體抗性菌株R3，抗性菌株和宿主菌在生化、毒力基因檢測方面無差異，抗性菌R3同宿主菌在MODE-K 細胞粘附能力方面差異較小。

3 討論

沙門菌噬菌體抗性菌的篩選鑒定及致病力研究能夠為噬菌體的實際應用提供理論依據(jù)，為噬菌體在抗感染治療方面的詳細應用奠定基礎。

本次研究中對沙門菌噬菌體通過次級感染法、瓊脂平板法進行篩查，通過裂解試驗得到了自發(fā)性穩(wěn)定的噬菌體抗性菌。通過次級培養(yǎng)可獲取抗噬菌體突變菌株?？剐跃拗骶鶠楦锾m氏陰性桿菌，且兩者在菌體與菌落形態(tài)方面差異較小?？剐跃倪z傳穩(wěn)定性較好，能夠?qū)κ删wPA13076 感染產(chǎn)生抵抗，噬菌體對抗性菌R3不具有吸附功能，分析可能是抗性菌表面受體發(fā)生異常改變，影響到噬菌體的識別與作用。

噬菌體抗性菌株同宿主菌相比，其致病力、粘附率都有所下降，表明動物體內(nèi)的噬菌體抗性菌毒性在呈現(xiàn)出下降趨勢，分析可能是因為動物體內(nèi)的免疫系統(tǒng)、吞噬細胞能夠更好的識別噬菌體抗性菌，造成其在動物體內(nèi)的毒性下降。細菌和噬菌體的進化在是自然中發(fā)生的，實驗室檢查中，細菌對噬菌體存在抗性，但是從現(xiàn)實角度分析，噬菌體抗性只是噬菌體治療期間可能遇到的一個問題。

仇笑笑[3]研究中指出噬菌體CR5 是一種裂解性噬菌體，長尾科，抑菌作用明顯，且具有較好的溫度耐受性。曹中贊等[4]分析了噬菌體制劑沙立寧對鵝源沙門菌感染的抑菌效果，研究證實噬菌體制劑沙立寧可明顯減少雛雞肝和盲腸載菌量，炎癥反應顯著減輕或消失，證實了噬菌體制劑沙立寧在鵝源沙門菌感染方面有較好的應用效果。

綜上所述，噬菌體同噬菌體宿主在毒力基因、生物學特性方面無變化，而噬菌體抗性菌株的致病力下降，MODE-K 細胞粘附能力不受影響。