超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定蔬菜中12 種殺菌劑

李顏巖，于浩洋，馮靜，陳曦，劉順鑫

(遼寧省疾病預(yù)防控制中心，沈陽(yáng) 110005)

殺菌劑是一類用來防治由病原微生物引起的植物病害的農(nóng)藥，因其投入低，回報(bào)高，作用迅速，效果明顯，被廣泛應(yīng)用于蔬菜生產(chǎn)過程中的病害防治［1］。蔬菜作為僅次于糧食的第二大農(nóng)產(chǎn)品，是人們?nèi)粘Ｉ钪斜夭豢缮俚氖澄镏?。我?guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》(GB 2763–2019)［2］對(duì)蔬菜中殺菌劑的限值作出了相應(yīng)規(guī)定。由于蔬菜生產(chǎn)周期和貨架期均較短，如果在生產(chǎn)過程中沒有按照相關(guān)規(guī)定控制殺菌劑的使用頻次、濃度和安全間隔期，容易造成蔬菜中殺菌劑殘留超標(biāo)，進(jìn)而危害人們身體健康［3］。我國(guó)種植的蔬菜品種多，病害和殺菌劑種類也繁多，為了擴(kuò)大防治范圍、減緩抗藥性、節(jié)省噴藥次數(shù)，經(jīng)常將幾種殺菌劑混合在一起使用［4］，因此建立快速、準(zhǔn)確，可同時(shí)測(cè)定多種殺菌劑的方法十分必要。

目前檢測(cè)殺菌劑常用的方法有氣相色譜法［5–6］、氣相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法［7–10］、液相色譜法［11–13］和液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法［14］。氣相色譜法和液相色譜法通過保留時(shí)間定性，相比質(zhì)譜法定性能力有限，同時(shí)檢測(cè)多種殺菌劑時(shí)，難以獲得較好的分離效果。近年來隨著高效、低毒、低殘留殺菌劑品種不斷涌現(xiàn)和越來越多非揮發(fā)性農(nóng)藥的研發(fā)，一些難揮發(fā)、熱穩(wěn)定性差的殺菌劑不適合采用氣相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)，而液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法多通道檢測(cè)功能不需要分析物之間實(shí)現(xiàn)完全色譜分離，一次性檢測(cè)多種化合物而不被干擾，可以縮短分析時(shí)間，且靈敏度較氣相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法高。樣品前處理是檢測(cè)過程中耗時(shí)最長(zhǎng)、工作量最大的部分，樣品前處理質(zhì)量的好壞直接影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和精密度。目前常用的樣品前處理方法主要有衍生法、液–液萃取法、固相萃取法等。衍生法對(duì)衍生反應(yīng)條件、人員操作熟練度要求嚴(yán)格；液–液萃取法和固相萃取法需要用大量的有機(jī)溶劑反復(fù)提取、定容，操作時(shí)間長(zhǎng)，試劑用量大，檢測(cè)成本高，且容易造成待測(cè)物損失，影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度?；赒uEChERS 原則的樣品處理技術(shù)操作簡(jiǎn)便，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員熟練度要求不高，試劑用量相對(duì)較少，分析范圍廣，速度快，準(zhǔn)確度高，近年來受到人們的廣泛關(guān)注，其應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。然而用該方法處理蔬菜樣品，采用超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定蔬菜中12 種常見殺菌劑的方法還沒見報(bào)道。筆者以乙腈為提取液對(duì)蔬菜樣品進(jìn)行萃取，上清液經(jīng)QuEChERS 分散固相萃取試劑盒凈化，建立了超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定蔬菜中12 種常見殺菌劑殘留的檢測(cè)方法。該方法試劑用量少，分析速度快，具有較高的準(zhǔn)確度和靈敏度，可以為蔬菜中殺菌劑殘留風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供科學(xué)、可靠的檢測(cè)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜儀–串聯(lián)質(zhì)譜儀：Acquity Xevo TQ 型，美國(guó)沃特斯公司；

電子天平：BS 110S 型，感量為0.1 mg，德國(guó)賽多利斯公司；

超純水系統(tǒng)：MILLI–Q Gradient 型，法國(guó)默克密理博公司；

渦旋振蕩器：Lab Dancer 型，德國(guó)艾卡公司；

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：ST16R 型，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；

高速離心機(jī)：TGL–16A 型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

QuEChERS 分 散 固 相 萃 取 試 劑 盒：5982–0028CH 型，規(guī)格為2 mL，內(nèi)含PSA 50 mg，C1850 mg，GCB 7.5 mg，MgSO4150 mg，美國(guó)安捷倫科技公司；

Pall-4544 PVDF 膜Acrodisc 針式濾器：孔徑為0.2 μm，直徑為13 mm，美國(guó)頗爾公司；

乙腈、甲醇：色譜純，美國(guó)費(fèi)希爾公司；

甲酸：色譜純，美國(guó)福祿克公司；

乙酸銨：色譜純，德國(guó)CNW 公司；

蔬菜樣品：市購(gòu)；

多菌靈、三唑酮、烯酰嗎啉、腐霉利、吡唑醚菌酯、惡霜靈標(biāo)準(zhǔn)品：純度均大于97%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 有限公司；

腈菌唑標(biāo)準(zhǔn)品：純度為99.6%，德國(guó)西格瑪奧德里奇公司；

實(shí)驗(yàn)用水為超純水；

5 種殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)溶液：基本信息見表1。

表1 5 種殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)溶液基本信息

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3 柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm，美國(guó)沃特世公司)；柱溫：40℃；進(jìn)樣體積：10.0 μL；流動(dòng)相：A 為乙腈，B 為0.05%甲酸水溶液；洗脫方式：梯度洗脫，流量為0.30 mL／min；梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子化模式：正離子電離模式(ESI+)；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式；離子源溫度：150℃；毛細(xì)管電壓：2.9 kV；錐孔反吹氣流量：50 L／h(氮?dú)?；錐孔氣流量：50 L／h；脫溶劑氣溫度：500℃；脫溶劑氣流量：800 L／h；12 種殺菌劑質(zhì)譜參數(shù)和 保留時(shí)間見表3。

表3 12 種殺菌劑質(zhì)譜參數(shù)和保留時(shí)間

1.3 樣品前處理

將采集的蔬菜樣品按GB／T 27404–2008［15］中蔬菜樣品的制備要求進(jìn)行搗碎均質(zhì)，放入密封樣品袋、塑料離心管或廣口瓶中，標(biāo)記好樣品信息，于–18℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?zhǔn)確稱取5.0 g 均質(zhì)后的蔬菜樣品，置于50 mL 塑料離心管中，加入10.0 mL 乙腈渦旋萃取5 min，然后以10 000 r／min 轉(zhuǎn)速離心5 min。取1.0 mL 上清液加入至QuEChERS分散固相萃取試劑盒中，手動(dòng)振搖5 min，渦旋1 min，然后以10 000 r／min 轉(zhuǎn)速離心3 min，上清液過PVDF 膜后上機(jī)測(cè)定。

1.4 溶液配制

多菌靈、三唑酮、烯酰嗎啉、腐霉利、吡唑醚菌酯、惡霜靈、腈菌唑7 種殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：1 000 μg／mL，準(zhǔn)確稱取7 種殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)品各0.01 g，分別置于7 只10 mL 容量瓶中，加入適量甲醇溶解，完全溶解后繼續(xù)加入甲醇定容至標(biāo)線，搖勻，于–18℃冰箱中保存。

5 種殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)溶液于–18℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

12 種殺菌劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確吸取上述7 種殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和5 種殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)溶液各適量，置于同一只10 mL 容量瓶中，用乙腈稀釋并定容至標(biāo)線，搖勻，配制成腐霉利的質(zhì)量濃度為10 μg／mL，吡唑醚菌酯、腈菌唑、惡霜靈的質(zhì)量濃度均為2 μg／mL，其它殺菌劑的質(zhì)量濃度均為1 μg／mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于4℃條件下保存。

系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：稱取5 份均質(zhì)后的陰性蔬菜樣品各5.0 g，置于5 只50 mL 塑料離心管中，分別加入適量體積的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和乙腈共10.0 mL，配制成腐霉利的質(zhì)量濃度分別為5.0，20.0，100.0，500.0，1 000.0 μg／L，吡 唑醚 菌酯、腈菌唑、惡霜靈的質(zhì)量濃度均分別為1.0，4.0，20.0，100.0，200.0 μg／L，其它殺菌劑的質(zhì)量濃度均分別為0.5，2.0，10.0，50.0，100.0 μg／L 的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液?；|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按1.3 樣品前處理方法進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

分別以相同比例的乙腈和甲醇與水混合作為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在低比例混合時(shí)，乙腈的洗脫能力更強(qiáng)，且壓力較低，12 種殺菌劑的色譜峰形和響應(yīng)值均好于甲醇為流動(dòng)相時(shí)，因此選用乙腈–水溶液作為流動(dòng)相。在正離子模式下，向水相中加入甲酸可以提高離子化效率，考慮到惡霜靈和嘧霉胺在弱酸至弱堿性條件下穩(wěn)定，可以適當(dāng)減少甲酸的加入量，故B 相選用0.05%甲酸水溶液。分別以乙腈–0.05%甲酸水溶液、乙腈–0.05%甲酸水溶液(含5 mmol 乙酸銨)為流動(dòng)相，考察12 種殺菌劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的色譜峰形和響應(yīng)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在B相中加入乙酸銨可以改善待測(cè)化合物的色譜峰形，但會(huì)降低目標(biāo)物的響應(yīng)值，比較加入乙酸銨前后的色譜圖，發(fā)現(xiàn)色譜峰形改善不明顯，但12 種殺菌劑的響應(yīng)均受到一定程度的抑制，尤其是對(duì)響應(yīng)較低的腐霉利影響較大，故B 相中不加乙酸銨。因此選用乙腈–0.05%甲酸水溶液為流動(dòng)相。

以乙腈–0.05%甲酸水溶液為流動(dòng)相，分別采用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)和ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 mm×100 mm，1.8 μm)兩種色譜柱對(duì)12 種殺菌劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)采用ACQUITY UPLC HSS T3 柱能夠獲得較好的色譜峰形和分離效果，故選擇ACQUITY UPLC HSS T3 柱作為分析柱。

以乙腈–0.05%甲酸水溶液為流動(dòng)相，采用ACQUITY UPLC HSS T3 柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)對(duì)12 種殺菌劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行分離，結(jié)果表明，梯度洗脫比等度洗脫分析時(shí)間短，且可以克服等度洗脫時(shí)間越長(zhǎng)化合物色譜峰越寬的缺點(diǎn)。優(yōu)化的梯度洗脫程序見表2。在優(yōu)化條件下12 種殺菌劑提取色譜圖如圖1 所示。

圖1 12 種殺菌劑提取色譜圖

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

由于12 種殺菌劑中含有氨基、仲胺或叔胺基團(tuán)，容易得到加成的正離子，在正離子電離模式(ESI+)下，可獲得豐度較高的［M+H］+母離子。通過子離子掃描方式選擇響應(yīng)最大的兩個(gè)碎片作為子離子，確定定量離子對(duì)和定性離子對(duì)，并對(duì)碰撞能量等質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表3。

2.3 凈化方法選擇

QuEChERS 分散固相萃取試劑盒中裝有PSA(N-丙基乙二胺)，C18，GCB(石墨化碳黑)和MgSO4，其中PSA 可以去除蔬菜樣品中的有機(jī)酸、脂肪酸、糖類、酚類以及極性色素；C18可以去除樣品中的脂肪、固醇及其它非極性干擾物，對(duì)于含脂肪較高的蔬菜樣品(黃豆芽等)有很好凈化效果；蔬菜樣品中往往色素含量很高，GCB 可以有效去除樣品中的色素；MgSO4可以去除樣品中的水分且不溶于乙腈，不會(huì)造成離子源的污染。經(jīng)QuEChERS分散固相萃取試劑盒處理后的樣品可以得到很好的回收率和精密度，且操作步驟簡(jiǎn)單。因此選擇QuEChERS 分散固相萃取試劑盒對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化。

2.4 提取液選擇

QuEChERS 分散固相萃取試劑盒常用乙腈或酸化乙腈(1%乙酸乙腈溶液)作為提取液，考慮到惡霜靈和嘧霉胺在弱酸到弱堿性條件下穩(wěn)定，因此選擇用乙腈為提取液。稱樣質(zhì)量(m)與提取液體積(V)比對(duì)提取效率有明顯影響，劉佳等［16］研究表明，當(dāng)m∶V=1∶2 時(shí)，回收率顯著增加。準(zhǔn)確稱量5 g 樣品，分別考察5，10，15 mL 乙腈對(duì)12 種殺菌劑的提取效果，結(jié)果顯示5 mL 乙腈的提取效率明顯低于10 mL 和15 mL 乙腈的提取效率，而10 mL 和15 mL 乙腈的提取效率差別不大，考慮到經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境保護(hù)，選擇10 mL 乙腈為提取液。

2.5 線性方程與檢出限

選取根莖類蔬菜蘿卜和葉菜類蔬菜白菜為基質(zhì)，按1.3 方法配制系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在1.2儀器工作條件下進(jìn)行測(cè)定。以12 種殺菌劑的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，定量離子對(duì)色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。將基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液逐級(jí)稀釋，在1.2 儀器工作條件下進(jìn)行測(cè)定，以3 倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為方法檢出限。12 種殺菌劑的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表4。

表4 12 種殺菌劑的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限

由表4 可知，兩種基質(zhì)中12 種殺菌劑在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.998，方法檢出限為0.02～0.66 μg／kg。

2.6 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取5.0 g 陰性蘿卜和白菜樣品各18 份，分別加入適量的12 種殺菌劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.4 方法進(jìn)行樣品處理，在1.2 儀器工作條件下分別進(jìn)行低、中、高3 個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平平行測(cè)定6 次，結(jié)果見表5。由表5 可知，12 種殺菌劑的平均加標(biāo)回收率為93.6%～107.5%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.93%～3.75%，滿足測(cè)定要求。表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。

表5 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.7 樣品測(cè)定

用所建方法對(duì)市售的16 份蔬菜樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，多菌靈和甲霜靈陽(yáng)性樣品各1 份，測(cè)定值均為11 μg／kg，苯醚甲環(huán)唑陽(yáng)性樣品3 份，測(cè)定值分別為6，9，40 μg／kg，均低于各自限值［2］，其余殺菌劑均未檢出。

3 結(jié)語(yǔ)

建立了12 種常見殺菌劑超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。選取乙腈為提取液，用QuEChERS 分散固相萃取試劑盒對(duì)蔬菜樣品進(jìn)行凈化，減少了有機(jī)試劑用量，操作簡(jiǎn)便，縮短了樣品前處理時(shí)間。采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線法進(jìn)行定量，在降低基質(zhì)效應(yīng)的同時(shí)補(bǔ)償了凈化過程中殺菌劑的損失。該方法準(zhǔn)確度高，精密度好，選擇性強(qiáng)，大樣本量檢測(cè)時(shí)間短，適用于蔬菜樣品中多種殺菌劑的同時(shí)測(cè)定，可以為蔬菜中殺菌劑殘留風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供科學(xué)、可靠的檢測(cè)數(shù)據(jù)。