紫莖澤蘭提取液對豬鏈球菌的抑菌活性研究

張小苗，周玉照*，張以芳

試驗研究

紫莖澤蘭提取液對豬鏈球菌的抑菌活性研究

張小苗1，周玉照1*，張以芳2

（1.大理農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 大理 671003；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明）

為了解紫莖澤蘭提取液對豬鏈球菌的抑菌效果。試驗通過將紫莖澤蘭的葉和莖分別進行提取，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至10g/ml，2種提取液分別對150μl豬鏈球菌(1×108個/ml)進行抑制效果測定、最低抑菌濃度測定、最低殺菌濃度測定。結(jié)果顯示，莖提取液的抑菌圈直徑是14.75±0.23mm；葉提取液抑菌圈直徑為8.12±0.50mm。葉提取液對豬鏈球菌的最低抑菌濃度為250mg/ml；莖提取液對豬鏈球菌的最低抑菌濃度為125mg/ml。葉和莖提取液對豬鏈球菌的最低殺菌濃度分別為500mg/ml和250mg/ml。紫莖澤蘭的葉和莖兩種提取液對豬鏈球菌有不同程度的抑制作用，且莖提取液對豬鏈球菌的抑菌效果優(yōu)于葉提取液。

紫莖澤蘭；提取液；豬鏈球菌；抑菌活性

紫莖澤蘭為菊科澤蘭屬多年生植物，是一種世界性的惡性雜草[1]。從近些年對紫莖澤蘭抑菌性的研究可以看出，紫莖澤蘭提取液以及所含的化學(xué)成分都具有一定的抑菌活性[2]。豬鏈球菌病是一種人畜共患的急性、熱性傳染病主要表現(xiàn)為急性出血性敗血癥、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、哺乳仔豬下痢和孕豬流產(chǎn)等。所以紫莖澤蘭提取液對豬鏈球菌有無抑菌效果的研究很有臨床意義。前人的研究表明，紫莖澤蘭95%乙醇提取物對兔癢螨和疥螨具有較強的離體殺滅活性；紫莖澤蘭石油醚萃取物對牛足螨也有較強的離體殺滅活性[3]；紫莖澤蘭經(jīng)甲醇石油醚丙酮萃取后對黏蟲觸殺效果較好的部位是花和葉[4]；紫莖澤蘭提取液可致弱雞球蟲卵囊活性[5]；紫莖澤蘭揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌有抗菌作用[6]；紫莖澤蘭乙酸乙酯部位具有良好的抗肝癌活性，能引起凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3與PARP的活化，從而誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡，但對正常肝細胞影響較小[7]；豬糞與紫莖澤蘭混合發(fā)酵可以提高發(fā)酵的產(chǎn)氣效果[8]；紫莖澤蘭提取物具有除糞臭和驅(qū)避蚊蠅效果[9]。目前，紫莖澤蘭提取物抑制動物病原菌的報道很少，試驗擬提取不同部位紫莖澤蘭成分浸提物，并分別對豬鏈球菌進行體外抑菌活性研究。試驗初步探討紫莖澤蘭不同部位提取液對豬鏈球菌的抑菌效果，以期為充分、合理利用紫莖澤蘭資源，使之變害為利提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

紫莖澤蘭全草采自公路邊；豬鏈球菌由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗室保存；血清瓊脂培養(yǎng)基、 MH肉湯均購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 紫莖澤蘭葉、莖提取液的制備 將采集的紫莖澤蘭葉、莖洗凈，晾干后各取500g剪碎后置于500ml錐形瓶中，加入400ml純凈水置于80℃恒溫水浴鍋中浸泡24h后，將提取液過濾，3000 r/min離心15min，取上清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器中蒸發(fā)濃縮為50ml，提取液終濃度為10g/ml。

1.2.2 豬鏈球菌的制備 抽取保存的豬鏈球菌菌液2ml于MH肉湯中，37℃恒溫培養(yǎng)18h，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 紫莖澤蘭不同部位提取液對豬鏈球菌的抑制效果測定 在血清瓊脂培養(yǎng)基中均勻涂布0.5ml豬鏈球菌，待表面干燥后用打孔器在涂菌的血清瓊脂培養(yǎng)基上均勻打孔，并在孔底在酒精燈火焰上略微加熱，使底部培養(yǎng)基熔化與平皿底壁緊密結(jié)合，分別抽取的紫莖澤蘭葉、莖提取液0.2ml加入各孔中，37℃恒溫培養(yǎng)24h后。分別觀察并測量抑菌圈直徑大小(mm)。

1.2.4 紫莖澤蘭不同部位提取液最低抑菌濃度的測定 用分光光度計校正豬鏈球菌菌液，使其含量約為1×108~2×108CFU/ml。取無菌試管20支，分二組，每組10支，第一組1~9管分別加入MH肉湯2ml；在第1管中加入紫莖澤蘭葉提取液2ml混勻，倍比稀釋至第8管，后從第8管中吸取2ml棄去，第10管加入2ml紫莖澤蘭葉提取液；第二組1~9管分別加入MH肉湯2ml；在第1管中加入紫莖澤蘭莖提取液2ml混勻，倍比稀釋至第8管，后從第8管中吸取2ml棄去，第10管加入2ml紫莖澤蘭莖提取液。將制備的豬鏈球菌菌液用MH培養(yǎng)液作1:1000稀釋，分別在兩個組的1~9管中加入0.1ml豬鏈球菌菌液，使每管最終菌液濃度約為1× 104~2×104CFU/ml。將接種好的稀釋管塞好塞子，置37℃孵育。以肉眼觀察培養(yǎng)物透明、不發(fā)生渾濁變化的最高液稀釋濃度作為紫莖澤蘭葉和莖提取液的最低抑菌濃度。

1.2.5 紫莖澤蘭不同部位提取液最低殺菌濃度的測定 測定出最低抑菌濃度后，再依次從未見細菌生長的各試管培養(yǎng)物中分別吸取0.1ml，接種于普通的平皿血清瓊脂培養(yǎng)基上，輕輕攤開菌液，37℃培養(yǎng)24h，觀察有無細菌生長。以菌落數(shù)少于5個視為無細菌生長，以無細菌生長的紫莖澤蘭葉和莖提取液最低濃度作為該最小殺菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫莖澤蘭不同部位提取液對豬鏈球菌的抑制效果

表1 紫莖澤蘭不同部位提取液的抑菌圈直徑 (mm)

紫莖澤蘭葉和莖提取液對豬鏈球菌均有一定的抑制效果，莖提取液抑菌圈直徑為14.75±0.23 mm，葉提取液抑菌圈直徑為8.12±0.50mm。說明莖提取液的抑菌效果優(yōu)于葉提取液(見表1)。

2.2 紫莖澤蘭不同部位提取液最低抑菌濃度

表2 紫莖澤蘭不同部位提取液的最低抑菌濃度(mg/ml)

紫莖澤蘭葉提取液對豬鏈球菌的最低抑菌濃度為250mg/ml，紫莖澤蘭莖提取液對豬鏈球菌的最低抑菌濃度為125mg/ml。說明紫莖澤蘭莖提取液對豬鏈球菌的抑菌效果強于葉提取液(見表2)。

2.3 紫莖澤蘭不同部位提取液最低殺菌濃度

紫莖澤蘭葉和莖提取液對豬鏈球菌的最低殺菌濃度分別為500mg/ml和250mg/ml。說明同一濃度的紫莖澤蘭葉和莖提取液對豬鏈球菌的殺菌效果莖強于葉(見表3)。

表3 紫澤蘭不同部位提取液的最低殺菌濃度(mg/ml)

3 討論

關(guān)于紫莖澤蘭的研究，目前的研究主要集中在其生物學(xué)特征、危害及其控制措施等方面。大量數(shù)據(jù)表明，紫莖澤蘭汁液對多種植物致病菌均有較高的抑制效果[2]。理論上講，紫莖澤蘭對動物致病菌也應(yīng)有抑制作用，但對紫莖澤蘭提取液抑制動物病原菌的報道幾乎沒有，基于這樣的設(shè)想，我們開展了紫莖澤蘭提取液對動物源性豬鏈球菌的抑菌活性研究。試驗結(jié)果顯示，紫莖澤蘭各部分的水提取液對豬鏈球菌均有不同程度的抑制作用。就總體情況來看，紫莖澤蘭莖的水提取液抑制效果比葉的水提取液的抑制效果好。這可能是葉中的抑菌活性成分較莖的少，也可能是因為水提取葉中的抑菌活性成分效果不如其他的溶劑好。因此，造成莖對豬鏈球菌的抑菌效果優(yōu)于葉的具體原因，還有待進一步研究，而且，關(guān)于紫莖澤蘭提取液的殺菌圖譜、作用方式和作用機制也有待進一步研究。

4 結(jié)論

目前，國內(nèi)對于植物提取液測定抑菌效果，還沒有標準的評價方法，無法根據(jù)抑菌圈直徑大小評定是否敏感，只能根據(jù)瓊脂擴散實驗抑菌圈的有無進行判定，抑菌圈越大說明效果就越好，至于抑菌圈達到多大才能算做敏感，還需要進一步的研究，因此還不能完全用于指導(dǎo)臨床用藥。這為豬鏈球菌病這一困擾養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的一大疾病的治療提供了一種新的可能的治療藥物，也為云南省紫莖澤蘭的進一步研究與開發(fā)應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

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（2020–07–20）

S853.73+2

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1007-1733(2020)11-0001-03