高效液相色譜法同時測定乳扇中的6種食品添加劑

李濤 楊偉 李蓉 趙海云 劉澤弘

摘 要：目的：建立一種高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）同時測定乳扇中的安賽蜜、檸檬黃、苯甲酸、糖精鈉、山梨酸和日落黃6種食品添加劑。方法：樣品除去脂肪后，用無水乙醇+氨水+水（體積比，7+2+1）提取后離心，取上清液濃縮至近干后加水復溶，高效液相色譜儀分析。色譜條件：色譜柱為C18柱，流動相為甲醇-0.02 mol/L乙酸銨，柱溫為35 ℃，流速為0.8 mL/min，用紫外檢測器在230 nm處檢測。結果：本方法6種組分在0.0～50 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關系，相關系數(shù)大于0.999 9，加標回收率為85.5%～112.6%，相對標準偏差為0.14%～3.55%。檢出限在0.15～1.40 mg/kg范圍內(nèi)的定量限在0.5～4.7 mg/kg。結論：該方法操作簡單，結果準確，適合乳扇中安賽蜜、檸檬黃、苯甲酸、糖精鈉、山梨酸和日落黃6種食品添加劑的同時檢測。

關鍵詞：高效液相色譜法;乳扇;食品添加劑;防腐劑;甜味劑;著色劑

乳扇是云南大理白族人民的一種傳統(tǒng)民族食品，屬于拉伸型干酪[1]，是將鮮牛乳加入煮沸的酸漿中經(jīng)凝乳、熱燙、拉伸等制成的食品[2]，酸漿是將未煮過的牛奶置于太陽下使其自然發(fā)酵變酸而得，也可以利用酸木瓜或梅子加水煮沸、靜置而得[3]。乳扇富含多種礦物元素和維生素，其中蛋白質含量達到30.4%，脂肪含量達到50%，鐵含量較其他乳制品高，可以達到5.5 mg/100 g[4]。乳糖不耐癥患者和糖尿病患者也可食用乳扇[5]，但由于乳扇中的蛋白質以大分子酪蛋白為主，且脂肪含量過高，不易被嬰幼兒消化吸收，故不宜作為嬰幼兒食品[6]。目前乳扇大部分是以家庭作坊的形式生產(chǎn)，制作乳扇的原料乳大多來自家庭散養(yǎng)的奶牛，產(chǎn)品質量難免會參差不齊。經(jīng)查閱文獻，目前對乳扇的研究主要集中于加工工藝[2，3，7]、營養(yǎng)成分[1，4，6]和金屬元素含量檢測[8-10]

方面，對乳扇中食品添加劑檢測的研究報道較少。因此，本工作擬建立一種高效液相色譜法同時測定乳扇中的安賽蜜、檸檬黃、苯甲酸、糖精鈉、山梨酸和日落黃，旨在為乳扇的質量控制提供方法參考。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

UItimate 3000高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）;Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（安捷倫科技有限公司）;JY5002電子天平（上海舜宇恒平儀器有限公司）;TDL-40B離心機（上海安亭科學儀器廠）;AS1709325超聲波清洗儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）;VORTEX2渦旋混勻器（DAIHAN Scientific Co.）;UPH-IV-20T超純水機（云南優(yōu)普科技有限公司）;THB-B數(shù)顯水浴恒溫振蕩器（常州市國立試驗設備研究所）。

安賽蜜、檸檬黃、苯甲酸、糖精鈉、山梨酸和日落黃標準溶液（濃度均為1 000 μg/mL，均購自壇墨質檢-標準物質中心）。

乙腈（色譜純，德國Merck公司）;海砂（含量≥99.8%，天津市光復精細化工研究所）;石油醚、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、無水乙醇、氨水、冰乙酸（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司）。

乳扇樣品購自大理當?shù)靥禺a(chǎn)店，切碎后置于4 ℃冰箱中冷藏備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制

分別吸取1.0 mL濃度為1 000 μg/mL的安賽蜜、檸檬黃、苯甲酸、糖精鈉、山梨酸和日落黃標準溶液于10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，配制成濃度為100 μg/mL的混合標準儲備液。

1.2.2 樣品前處理方法

稱取2 g（精確到0.01 g）樣品置于研缽中，加入10 g海砂和2 mL超純水，研磨混勻，吹冷風使試樣干燥，加入50 mL石油醚，混勻，靜置片刻，棄去石油醚，重復處理3次，吹干后轉入50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL

無水乙醇+氨水+水（體積比，7+2+1）溶液，超聲提取10 min后依次加入

2.5 mL亞鐵氰化鉀（106 g/L）溶液和2.5 mL乙酸鋅（219 g/L）溶液，渦旋混勻1 min，4 000 r/min離心5 min，上清液轉移至100 mL燒杯中，于殘渣中加入10 mL無水乙醇+氨水+水（體積比，7+2+1）溶液，渦旋混勻1 min后超聲提取5 min，4 000 r/min離心5 min后合并上清液至同一100 mL燒杯中，重復操作3～5次，直至殘渣中無色素殘留。將上清液用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至7.0，于80 ℃水浴蒸發(fā)至近干后，用超純水定容至10 mL，過

0.22 μm聚醚砜微孔濾膜，上機檢測。

1.2.3 高效液相色譜條件

Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm），5-Micron;流動相：甲醇-0.02 mol/L乙酸銨，梯度洗脫，洗脫程序見表1;柱溫：35 ℃;進樣量：10 μL;紫外檢測波長：230 nm。

2 結果與分析

2.1 樣品的處理

乳扇中含有大量的蛋白質和脂肪，故本試驗未直接加提取液提取，而是先在樣品中加入適量海砂和水，充分研磨使其均勻分散開，加入石油醚除去脂肪后再加提取液提取，由于蛋白質是一種膠體，亞鐵氰化鉀和乙酸鋅反應生成的氰亞鐵酸鋅沉淀能夠挾走或吸附干擾物質，且這兩種高濃度的鹽離子水化能力很強，能夠奪取蛋白質分子的水化層，對蛋白質的溶解度有顯著影響，能有效沉淀樣品中的蛋白質[11]，故本試驗選擇106 g/L亞鐵氰化鉀溶液和219 g/L乙酸鋅溶液來去除樣品中的蛋白質。

2.2 樣品的提取

亞鐵氰化鉀和乙酸鋅反應生成的氰亞鐵酸鋅沉淀會吸附檸檬黃和日落黃，用超純水提取很難將其洗脫下來。安賽蜜、檸檬黃和日落黃是水溶性化合物，易溶于水和極性溶液，苯甲酸、山梨酸和糖精鈉在堿性條件下以鹽的形式存在，可溶于強極性溶劑。查閱相關文獻[12-15]，通常用氨化乙醇和氨化甲醇來洗脫合成著色劑，考慮到高濃度的乙醇可使蛋白質脫水，促進蛋白質的凝聚，同時乙醇可起到破壞沉淀膠體減少干擾的作用[16]，本試驗選擇無水乙醇+

氨水+水（體積比，7+2+1）作為提

取劑。

為防止堵塞、污染色譜柱和管路系統(tǒng)，在上機檢測前應使用微孔濾膜過濾。試驗發(fā)現(xiàn)，尼龍濾膜對檸檬黃和日落黃有較強的吸附作用，而聚醚砜濾膜幾乎不吸附這6種組分，因此，在上機前先用0.22 μm聚醚砜微孔濾膜過濾。6種食品添加劑的色譜圖見

圖1。

2.3 線性和檢出限

分別吸取0.00、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 、2.00 mL與5.00 mL

濃度為100 μg/mL的混合標準儲備液于10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，配制成濃度為0.0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL和50.0 μg/mL的標準工作溶液，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。6種組分混合標準溶液的色譜圖見圖2。在樣品中添加一定量的混合標準使用液，按2.1中的方法處理后上高效液相色譜儀檢測，稱樣量按2 g計，以3倍信噪比（S/N）所對應的濃度計算檢出限;以10倍信噪比（S/N）對應的濃度計算定量限，6種組分的線性方程、線性范圍、相關系數(shù)、檢出限與定量限列于表2。

從表2可以看出，各組分在0.0～

50 μg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關系，相關系數(shù)大于0.999 9，檢出限為0.15～1.40 mg/kg，定量限為0.5～4.7 mg/kg，滿足待測組分的檢測要求。

2.4 加標回收率

準確稱取2 g（精確到0.01 g）樣品于研缽中，分別加入0.1、0.2、

0.50 mL濃度為100 μg/mL的混合標準儲備液，混勻，分別制成6種食品添加劑含量均為5、10、25 mg/kg

3個濃度水平的加標樣品，每個濃度水平做6個平行測定，按照2.1項下方法處理樣品后測量，測量結果列于表3。從表3中可以看出，樣品的加標回收率在85.5%～112.6%，相對標準偏差為0.14%～3.55%。表明方法的準確度良好。

3 結論

本研究建立了一種高效液相色譜法同時測定乳扇中安賽蜜、檸檬黃、苯甲酸、糖精鈉、山梨酸和日落黃的方法。在最佳條件下，樣品的加標回收率為85.5%～112.6%，相對標準偏差為0.14%～3.55%，檢出限在0.15～1.40 mg/kg，定量限在0.5～4.7 mg/kg。本方法線性關系良好，回收率高，精密度好，能夠為乳扇的質量控制提供一定的數(shù)據(jù)支持和方法參考。

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作者簡介：李濤（1987—），男，彝族，云南玉溪人，本科，助理工程師。研究方向：食品安全檢測與研究。

楊偉（1987—），男，白族，云南大理人，碩士，工程師。研究方向：食品安全分析與檢測研究。

李蓉（1988—），女，漢族，四川眉山人，碩士，工程師。研究方向：食品安全質量檢測。

趙海云（1988—），女，漢族，云南大理人，碩士，助理工程師。研究方向：食品安全檢測與研究。

劉澤弘（1987—），男，漢族，云南大理人，本科，助理工程師。研究方向：食品安全檢測。