超聲處理對(duì)組織工程骨支架性能的影響

劉 陽(yáng) ，許 燕 ，2，周建平 ，2，張鐘毓

（1.新疆大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2.西安交通大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院，陜西 西安 710049）

1 引言

骨具有強(qiáng)度高，脆性低，硬度大且具有韌性，此外還具備高強(qiáng)度并且有多孔結(jié)構(gòu)的特性，這些矛盾的特性能同時(shí)具備，是通過(guò)從分子上到宏觀可分辨的尺度的多級(jí)結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)共同協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)的結(jié)果[1]。目前，骨組織工程作為近年來(lái)新興的骨修復(fù)處理方法，在骨科、矯形外科以及口腔外科等眾領(lǐng)域進(jìn)行了廣泛探索應(yīng)用，是進(jìn)行研究的前沿性課題，在臨床及產(chǎn)業(yè)化方面具有很好前景。

組織工程目的在于通過(guò)采取一系列方式方法將活細(xì)胞、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與支架載體比較理想地結(jié)合在一起，經(jīng)過(guò)組織工程骨支架材料在生物體內(nèi)逐漸降解，同時(shí)伴隨著附著于支架的細(xì)胞分化增殖，從而生成出新骨組織。HA 復(fù)合材料組織工程骨支架是屬于對(duì)組織工程支架進(jìn)行研究探索的熱點(diǎn)方向之一[2]。其中，HA 復(fù)合絲素蛋白組織工程多孔隙骨支架是HA 復(fù)合材料組織工程骨支架的一條重要分支，目前其制備處理方法主要是通過(guò)冷凍干燥和高溫?zé)Y(jié)等加工工藝方式進(jìn)行強(qiáng)化處理，高溫?zé)Y(jié)可控性差，且容易產(chǎn)生裂紋，其中普遍存在無(wú)法使組織工程骨支架在一定孔隙條件下同時(shí)兼有優(yōu)良韌性和抗壓強(qiáng)度的問(wèn)題，此外支架表面孔隙形貌也一直是研究熱點(diǎn)領(lǐng)域。

超聲波根據(jù)用途可歸成檢測(cè)超聲和功率超聲兩種類型，功率超聲主要是利用能量來(lái)加工和處理工件[3]。超聲波在液體中傳播的形式是通過(guò)形成一系列壓縮波以及稀疏波來(lái)進(jìn)行傳播的，其分別相對(duì)應(yīng)地生成一系列正壓及負(fù)壓，并構(gòu)成有規(guī)律地正壓與負(fù)壓交替的周期，能夠在液體條件下生成空穴效應(yīng)，微流束效應(yīng)，熱效應(yīng)及機(jī)械效應(yīng)[4]。故超聲波可通過(guò)對(duì)液體的作用，不僅僅可以對(duì)HA 復(fù)合絲素蛋白組織工程骨支架進(jìn)行表面改性處理，而且還可以改變其內(nèi)部的組織結(jié)構(gòu)，從而改變其性能。

故針對(duì)目前HA 復(fù)合絲素蛋白組織工程骨支架無(wú)法兼有優(yōu)良韌性、抗壓抗剪切強(qiáng)度和較好支架表面形貌孔隙的問(wèn)題，而提出一種特殊加工工藝方法—超聲波處理法，并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)探究。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)原料與設(shè)備

羥基磷灰石（純度96%，粒徑40nm，南京某納米材料有限公司）；聚乙烯醇（北京某科技有限公司）；絲素蛋白（粒徑350nm，湖州新天絲生物技術(shù)有限公司）；蒸餾水（pH=6.5～7，河南新源科技有限公司）；HH-1 數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市城某儀器廠）；BCD-301WBD 冰箱（合肥某股份有限公司）；SU8000 掃描電鏡（日本某高新技術(shù)有限公司）；高精度數(shù)字電子秤（浙江某集團(tuán)有限公司）；超聲波分散均勻儀（深圳市某電子有限公司）；X-射線衍射儀（美國(guó)某公司）；恒溫箱；數(shù)顯恒溫磁力攪拌器實(shí)驗(yàn)室90-2 高溫型磁力加熱攪拌機(jī)（常州某儀器制造有限公司）；紅外光譜儀（VERTEX-70，德國(guó)BRUKER）；微機(jī)控制電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)（WDW-20，方辰儀器設(shè)備公司，濟(jì)南）。

2.2 聚乙烯醇/絲素蛋白復(fù)合凝膠的制備

將 SF 粉末與 PVA 晶粒按照（SF：PVA=1：4）混合，并加入蒸餾水，然后將混合懸濁液放在數(shù)顯恒溫磁力攪拌器實(shí)驗(yàn)室90-2 高溫型磁力加熱攪拌機(jī)上加熱至90℃，持續(xù)處理60 min，使兩者能夠充分混合溶解，制備出SF-PVA 復(fù)合凝膠，并放入冰箱低溫保存。

2.3 樣品的處理與表征

將 SF 粉末制備的 SF-PVA（1：4）復(fù)合凝膠與 HA 按照配比為1.5：1 充分混合，利用自行研制的機(jī)械式擠出3D 打印裝置制備出 3 批相同的 24 個(gè)（10×10×4）mm 的正方形組織工程骨支架試驗(yàn)樣品，如圖1 所示。

圖1 組織工程骨支架Fig.1 Tissue Engineering Bone Scaffold

將其平均分成4 組，第一組作為對(duì)照組，進(jìn)行完冷凍干燥處理后進(jìn)行40℃恒溫干燥。第（2～4）組進(jìn)行完冷凍干燥處理后浸入蒸餾水中，在0℃水浴內(nèi)，頻率在40Hz 下根據(jù)不同時(shí)間（90s、280s和480s）進(jìn)行超聲波處理，然后放恒溫箱調(diào)至40℃進(jìn)行干燥處理。用低倍掃描電鏡觀察分析PVA/SF/HA 復(fù)合材料組織工程支架表面的微觀形貌；采用紅外光譜儀和X 射線衍射儀分別對(duì)材料中組分的變化進(jìn)行分析研究；采用高倍掃描電鏡分析支架內(nèi)部的顆粒結(jié)構(gòu)；采用微機(jī)控制電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)對(duì)所制備支架分別進(jìn)行壓縮實(shí)驗(yàn)和剪切實(shí)驗(yàn)，分析支架的力學(xué)性能變化。

3 結(jié)果與討論

3.1 低倍 SEM 分析

支架表面是細(xì)胞與植入支架首先進(jìn)行接觸的部位，故其對(duì)于細(xì)胞對(duì)植入支架的反應(yīng)效果有重要影響，因此對(duì)骨組織工程支架進(jìn)行表面改性處理，改善表面結(jié)構(gòu)形貌可以提高支架在生物體內(nèi)的結(jié)合程度[5]。研究認(rèn)為，表面微結(jié)構(gòu)、孔隙及表面粗糙度等對(duì)細(xì)胞在支架上的粘附、增殖以及分化均有重要的意義，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸附也有重要的影響。因此，在支架表面構(gòu)造成表面粗糙的多孔隙結(jié)構(gòu)具有重要意義。試驗(yàn)樣品的低倍SEM 圖，如圖2 所示。由圖可知，對(duì)照組的PVA/SF/HA 復(fù)合材料組織工程骨支架表面光滑，粗糙度低基本沒(méi)有微米孔隙，這不利于細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的附著，通過(guò)超聲波處理的支架，其表面發(fā)生明顯變化，表面變得粗糙，并且表面存在較多微米級(jí)孔隙，并且隨著超聲波處理時(shí)間的增加，表面孔隙明顯增加，這有助于支架表面吸附營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞的附著與生長(zhǎng)，有利于提高PVA/SF/HA 復(fù)合材料組織工程骨支架在體內(nèi)的整合。

圖2 低倍SEM 組織工程骨支架表面孔隙形貌Fig.2 Surface Pore Morphology of Low Power SEM Tissue Engineering Bone Scaffold

3.2 FT-IR 分析

FTIR 譜可以用來(lái)觀察和檢測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中較細(xì)微的變化情況，可把這變化歸類為其二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，二級(jí)結(jié)構(gòu)通常包含有β-折疊、α-螺旋等較為規(guī)則的結(jié)構(gòu)以及各種環(huán)形和轉(zhuǎn)角等卷曲無(wú)規(guī)則類結(jié)構(gòu)等，各種二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是靠亞胺基上氫原子之間氫鍵和肽鏈骨架上羥基上氧原子維系[6]。在此實(shí)驗(yàn)中，紅外光譜主要是為了表征復(fù)合粉體中SF 的存在及存在狀態(tài)，故截取PVA/SF/HA 復(fù)合材料粉末在400～2000cm-1的紅外吸收光譜[7]。絲素蛋白的酰胺特征峰與其二級(jí)結(jié)構(gòu)之間對(duì)應(yīng)關(guān)系是解析紅外光譜關(guān)鍵點(diǎn)，對(duì)應(yīng)關(guān)系：酰胺I 反應(yīng)C=0 伸縮振動(dòng)；酰胺II 反應(yīng)C-N 伸縮及N-H 變形協(xié)同運(yùn)動(dòng)；酰胺III 反應(yīng)C-N 的伸縮振動(dòng)及N-H 面內(nèi)變形振動(dòng)[8]。絲素蛋白的紅外光譜特征峰經(jīng)驗(yàn)值，如表1 所示。

表1 絲素蛋白紅外光譜特征峰Tab.1 Characteristic Peaks of the IR Spectrum of Silk Fibroin

為研究不同超聲波處理時(shí)長(zhǎng)對(duì)PVA/SF/HA 復(fù)合材料骨支架的SF 構(gòu)象中二級(jí)結(jié)構(gòu)影響，本實(shí)驗(yàn)先將其碎成粉末狀，然后對(duì)粉末進(jìn)行FTIR 測(cè)試，如圖3 所示。從圖可看出在未經(jīng)超聲波處理的PVA/SF/HA 復(fù)合材料中，SF 的酰胺I 在1640cm-1處有明顯的特征吸收峰，酰胺II 在1516cm-1處表現(xiàn)出較弱不明顯的特征吸收峰，PVA/SF/HA 復(fù)合材料支架經(jīng)超聲波90s、280s、480s 分別處理后，SF 的酰胺II 在1516cm-1處均出現(xiàn)了明顯的特征吸收峰，并且隨著時(shí)間的長(zhǎng)度增加，SF 的酰胺I 和酰胺II 的β-折疊結(jié)構(gòu)的含量均有所增加，這些現(xiàn)象均有助于提高支架材料的穩(wěn)定性。

圖3 組織工程骨支架紅外光譜圖Fig.3 Infrared Spectrogram of Tissue Engineering Bone Scaffold

3.3 XRD 分析

PVA/SF/HA 組織工程支架XRD 譜圖，如圖4 所示。由圖4知，該復(fù)合支架材料主要呈現(xiàn)HA 的特征峰，復(fù)合材料HA 的晶相結(jié)構(gòu)已經(jīng)出現(xiàn)，在圖中很難發(fā)現(xiàn)SF/PVA 所呈現(xiàn)的特征峰。此外從中可看出，經(jīng)過(guò)超聲波處理加工后，HA 各晶面衍射峰的強(qiáng)度均明顯提高，各衍射峰未發(fā)生偏移現(xiàn)象，且隨著超聲波時(shí)間的增加，可代表 HA 的（211）、（002）與（213）晶面的三個(gè)特征峰均呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢(shì)，故HA 結(jié)晶度提高，這均有助于PVA/SF/HA 復(fù)合材料組織工程骨支架力學(xué)性能的提升。

圖4 組織工程骨支架XRD 圖譜Fig.4 XRD Atlas of Tissue Engineering Bone Scaffold

3.4 高倍 SEM 分析

PVA/SF/HA 復(fù)合材料粒子的SEM 圖，如圖5 所示。顆粒形貌不僅僅影響復(fù)合材料的力學(xué)性能，而且影響復(fù)合材料的生物降解性能，如棒狀結(jié)構(gòu)的納米粒子更易于被細(xì)胞吞噬[9]，由圖可知，未經(jīng)超聲波加工處理的粒子形貌為絮狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)的力學(xué)性能差，經(jīng)超聲波加工處理的粒子形貌為棒狀，這有助于提高其力學(xué)強(qiáng)度[10]。通過(guò)圖還可看出，隨超聲波處理時(shí)間增加，棒狀顆粒數(shù)量越多。

圖5 高倍SEM 組織工程骨支架微納米顆粒形貌Fig.5 Morphology of Micro and Nano Particles in Tissue Engineered Bone Scaffolds of High Power SEM

3.5 壓縮性能實(shí)驗(yàn)

將4 組方案，每種方案6 個(gè)樣件，放在微機(jī)控制電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)上進(jìn)行壓縮實(shí)驗(yàn)測(cè)試，測(cè)試環(huán)境為室溫，壓縮速度1mm/min，得出實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并用Origin8.5 作出試驗(yàn)力—變形曲線圖，如圖6 所示。

圖6 壓縮力-變形曲線Fig.6 Compressive Force Deformation Curve

由圖可知，PVA/SF/HA 復(fù)合材料組織工程骨支架在承受力的過(guò)程中幾乎未發(fā)生脆性斷裂，說(shuō)明其有優(yōu)良的韌性，在（0～1500）N 區(qū)間內(nèi)，試驗(yàn)力—變形曲線近似直線，彈性模量公式：

式中：E—彈性模量，MPa；σ—正應(yīng)力，MPa；ε—應(yīng)變；F—正應(yīng)力MPa；A—受力接觸面面積 mm2；L—試樣高度，mm；ΔL—變形量。

因?yàn)樵嚇邮芰佑|面面積和試樣高度是定值，故彈性模量是圖中試驗(yàn)力—變形曲線的斜率，從圖中可以看出，經(jīng)超聲波處理明顯提高了支架的彈性模量，支架抵抗變形的能力明顯增強(qiáng)，有助于支架孔隙及各方面性能保持穩(wěn)定。

3.6 剪切性能實(shí)驗(yàn)

同理，將4 組方案，每種方案6 個(gè)樣件，放在微機(jī)控制電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)上，對(duì)試樣的中間部位進(jìn)行剪切實(shí)驗(yàn)測(cè)試，最終將得到的數(shù)據(jù)用Origin8.5 作圖，如圖7 所示。由圖可知，經(jīng)超聲波處理過(guò)的支架抗剪切強(qiáng)度明顯改善，此外，在處理時(shí)長(zhǎng)為280s 時(shí)，因支架內(nèi)部多孔隙結(jié)構(gòu)分布不均，曲線在0.25mm 處出現(xiàn)了局部坍塌，但產(chǎn)生了曲線折返，故未使支架失穩(wěn)。

圖7 剪切力-變形曲線Fig.7 Shear Stress Deformation Curve

4 結(jié)論

（1）XRD、FT-IR 和SEM 綜合分析結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)超聲波處理的骨支架穩(wěn)定性明顯提高，由力學(xué)性能分析結(jié)果可知，在固定宏觀孔隙下，支架的彈性模量和抗剪切性能明顯改善。

（2）經(jīng)超聲波處理的骨支架，支架表面孔隙和形貌有了顯著地改善，有利于細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)附著在表面，并且隨著超聲波處理時(shí)間的增長(zhǎng)，骨支架表面孔隙有明顯增加。

（3）在微觀結(jié)構(gòu)下，經(jīng)超聲波處理過(guò)的HA 的結(jié)晶度明顯提高，SF 的β-折疊結(jié)構(gòu)明顯增強(qiáng)，微觀顆粒呈棒狀結(jié)構(gòu)，這對(duì)后期降解和載藥性能的研究都有重要意義。