海洋線蟲(chóng)Litoditis marina酸性pH脅迫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組分析*

叢巖懿 謝玉素 張留所①

海洋線蟲(chóng)酸性pH脅迫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組分析*

叢巖懿1, 2, 3, 4謝玉素1, 2, 3張留所1, 2, 3①

(1. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266237; 3. 中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心 青島 266071; 4. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

工業(yè)革命以來(lái), 二氧化碳排放導(dǎo)致了海洋酸化。海水pH下降對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖、代謝和免疫等多個(gè)生命過(guò)程產(chǎn)生重要影響, 但海洋無(wú)脊椎動(dòng)物如何感知和響應(yīng)酸性pH脅迫的分子機(jī)制還很不清楚。本研究以團(tuán)隊(duì)建立的海洋線蟲(chóng)品系為模型, 對(duì)其在不同酸性pH條件下的表型特征及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明, 當(dāng)pH從實(shí)驗(yàn)室最佳生長(zhǎng)條件5.92下降到5.33時(shí),.生長(zhǎng)發(fā)育的速度明顯減慢, 但依然可以產(chǎn)卵繁殖; 但當(dāng)pH下降到4.33時(shí),.的生長(zhǎng)受到嚴(yán)重影響, 表現(xiàn)為不能長(zhǎng)成成體且不能產(chǎn)卵繁殖。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析, 發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH從5.92下降到4.33時(shí), 海洋線蟲(chóng).脂肪酸β-氧化通路基因和不飽和脂肪酸合成相關(guān)基因表達(dá)上調(diào); 表皮相關(guān)基因表達(dá)則呈現(xiàn)差異變化, 2個(gè)基因和6個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào), 表皮膠原基因類(lèi)基因的表達(dá)沒(méi)有發(fā)生顯著變化; 細(xì)胞色素P450通路相關(guān)基因、凝集素C基因和HSP70家族基因的表達(dá)量顯著上調(diào)。當(dāng)pH從5.92下降到5.33時(shí), 上述提到的這些上調(diào)基因中的大多數(shù)沒(méi)有發(fā)生顯著變化。我們發(fā)現(xiàn)的海洋線蟲(chóng)應(yīng)答酸化脅迫的主要調(diào)控模式, 為理解生物體能夠在低pH環(huán)境中生存的分子機(jī)制提供了參考, 為篩選和識(shí)別生物體響應(yīng)和適應(yīng)酸化脅迫的關(guān)鍵基因奠定了基礎(chǔ)。

海洋線蟲(chóng);; 酸性pH脅迫; 脂肪酸β-氧化; 物質(zhì)代謝細(xì)胞色素P450通路

海洋生物作為海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成, 需要適應(yīng)其生存環(huán)境的非生物因素, pH就是常見(jiàn)非生物因素之一(隋永年, 1986)。自工業(yè)革命以來(lái), 由于人類(lèi)大量的開(kāi)采使用煤、石油和天然氣等化石燃料, 并砍伐了大量樹(shù)木植被, 大氣中的二氧化碳含量水平逐年上升。海洋吸收大氣中的二氧化碳, 導(dǎo)致二氧化碳分壓升高, 海水pH降低, 造成海洋酸化(Havenhand, 2019)?；どa(chǎn), 礦物燃料的燃燒, 交通運(yùn)輸?shù)犬a(chǎn)生的酸性氣體也會(huì)通過(guò)大氣形成雨、霧、雪等向海洋輸送, 使得近海和遠(yuǎn)海的表層海水的pH值降低(石強(qiáng)等, 2011)。污染物及工業(yè)廢水的排放, 例如基于形成水合物策略的海水淡化技術(shù)中排放的酸性污水等, 也會(huì)導(dǎo)致近岸海水pH降低(Montgomery, 2009)。

海水酸化的直接后果是對(duì)海洋生物的生長(zhǎng)發(fā)育、代謝、鈣化、行為等過(guò)程產(chǎn)生影響。當(dāng)水體從pH 8.3降低到6.9時(shí), 凡納濱對(duì)蝦的腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)遭到破壞, 消化和代謝相關(guān)的酶的活性被誘導(dǎo)改變(Duan, 2019)。低pH條件下, 極地鱈魚(yú)的游泳能力下降(Kunz,2018)。當(dāng)海水pH從8.1下降到7.4時(shí), 珍珠貝殼的生長(zhǎng)受到明顯抑制, 殼基質(zhì)蛋白基因表達(dá)顯著下調(diào)(Liu, 2017)。

海洋線蟲(chóng), 曾用名(,), 隸屬于線蟲(chóng)動(dòng)物門(mén)(Nematoda), 色矛綱(Chromadorea), 小桿目(Rhabditida), 小桿科(Rhabditidae),屬; 與生物醫(yī)學(xué)模式生物秀麗線蟲(chóng)屬于同一個(gè)科。.為雌雄異體, 繁殖上限溫度為25°C, 在9—25°C范圍內(nèi), 該物種的發(fā)育速度會(huì)隨著溫度的升高而加快(Moens, 2000)。在20°C左右, 鹽度為20左右的條件下.產(chǎn)生的子代數(shù)量最多(Moens, 2000)。目前關(guān)于海洋線蟲(chóng).在不同pH條件下的生長(zhǎng)發(fā)育及其調(diào)控機(jī)制尚未報(bào)道(曹緒文等, 2018; Xie, 2020)。

酸性pH脅迫普遍存在并且會(huì)給生物體帶來(lái)一系列負(fù)面影響, 因此研究生物體響應(yīng)環(huán)境酸性pH脅迫的生物學(xué)機(jī)制意義重大。由于海洋兩性繁殖無(wú)脊椎動(dòng)物中還沒(méi)有真正意義的模式生物, 所以目前關(guān)于海洋無(wú)脊椎動(dòng)物應(yīng)對(duì)海水酸性pH脅迫的分子機(jī)制的研究還不夠深入。作者所在團(tuán)隊(duì)經(jīng)過(guò)3年努力, 已經(jīng)構(gòu)建了成熟的海洋線蟲(chóng)模式體系(Xie, 2020)。本研究以海洋線蟲(chóng)為研究對(duì)象, 通過(guò)線蟲(chóng)響應(yīng)不同pH環(huán)境的表型實(shí)驗(yàn)與轉(zhuǎn)錄組分析, 以期為探究無(wú)脊椎動(dòng)物應(yīng)答酸性pH脅迫的分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 品系的獲得

海洋線蟲(chóng)初始樣本采集于山東青島匯泉灣潮間帶, 相較于常規(guī)的秀麗線蟲(chóng)NGM培養(yǎng)基(pH為6.33),.在海水NGM培養(yǎng)基(pH為5.92)的生長(zhǎng)與繁殖更好。實(shí)驗(yàn)室也嘗試通過(guò)添加Tris-HCl和KOH等試劑調(diào)節(jié)海水NGM培養(yǎng)基的pH至7.7(匯泉灣海水的pH為7.7左右), 但.的生長(zhǎng)情況并不是很好。經(jīng)過(guò)很多的摸索和嘗試, 最終選擇了海水NGM培養(yǎng)基(pH為5.92)作為.的最佳培養(yǎng)基。本研究中使用的線蟲(chóng)是經(jīng)過(guò)2年實(shí)驗(yàn)室馴化培養(yǎng)后的.品系, 20°C條件下培養(yǎng)于接種大腸桿菌.OP50的海水NGM培養(yǎng)板。

1.2 海洋線蟲(chóng)的同步化

在已接種OP50的海水培養(yǎng)板上培養(yǎng)海洋線蟲(chóng), 至平板上有大量蟲(chóng)卵分布時(shí), 收集蟲(chóng)卵至15mL離心管中, 3600, 離心2min。棄上清后加入滅菌水清洗2次。在室溫下用堿性次氯酸鹽溶液處理蟲(chóng)卵30s, 1300, 離心1min。用滅菌水清洗卵沉淀2次, 1300, 離心1min去上清后再加入海水(Da Silva, 2005)。用玻璃管轉(zhuǎn)移卵液至空的培養(yǎng)基平板上(有OP50, 1滴卵液/板), 20°C孵化過(guò)夜, 孵育20h后得到大量同步化的海洋線蟲(chóng)L1幼蟲(chóng)。

1.3 海洋線蟲(chóng)表型實(shí)驗(yàn)

鑒于目前實(shí)驗(yàn)室海洋線蟲(chóng)最佳培養(yǎng)基的pH為5.92, 本研究以pH 5.92為對(duì)照組, pH 5.33、pH 4.33和pH 3.33為酸性脅迫組。配制特定pH的海洋線蟲(chóng)培養(yǎng)基小板(1.7g Agar, 0.25g Peptone, 97.5mL海水, 0.1mL 1mol/L MgSO4, 0.1mL 1mol/L CaCl2, 0.1mL 5mg/mL膽固醇乙醇溶液, 通過(guò)適量50%鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH, 加入2.5mL 1mol/L K2HPO4緩沖溶液使其保持一個(gè)穩(wěn)定的pH), 每個(gè)pH小板接種10μL大腸桿菌OP50。待菌液干燥后, 每個(gè)pH小板轉(zhuǎn)入70只同步化的L1幼蟲(chóng), 觀察它們的生長(zhǎng)發(fā)育情況, 記錄每個(gè)平板上觀察到的最早出現(xiàn)海洋線蟲(chóng)成體的時(shí)間。每個(gè)pH條件進(jìn)行3個(gè)重復(fù)。

1.4 RNA-seq建庫(kù)準(zhǔn)備及RNA-seq分析

通過(guò)1.2的方法得到大量的同步化的L1海洋線蟲(chóng)幼蟲(chóng)后, 用M9溶液將L1幼蟲(chóng)從培養(yǎng)基上洗脫下來(lái), 轉(zhuǎn)入15mL離心管中, 1300, 離心2min后棄上清。將收集的L1幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到已接種OP50的直徑9cm的pH平板上, 每個(gè)pH平板上放約60000只線蟲(chóng)。20°C孵育3h后用M9溶液分別洗脫在不同pH環(huán)境下的L1幼蟲(chóng), 將洗脫液轉(zhuǎn)入15mL離心管中, 3600離心2min去上清, 再加入M9溶液離心去上清, 如此反復(fù), 洗滌三次, 去除大部分殘留細(xì)菌。然后將L1線蟲(chóng)樣品轉(zhuǎn)移到1.5mL的離心管中, 2000離心5min, 除去多余的上清。樣品立即在液氮中冷凍5min, –80°C保存。每個(gè)pH條件實(shí)驗(yàn)(pH 4.33, pH 5.33和pH 5.92)進(jìn)行三次重復(fù)。

將樣本用液氮迅速研磨后, 通過(guò)Trizol法提取RNA。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和Agilent 2100 Bioanalyzer分析樣品RNA完整性及是否存在DNA污染; 通過(guò)Qubit2.0 Fluorometer對(duì)RNA濃度進(jìn)行精確定量。使用Illumina的NEBNext? UltraTM RNA Library Prep Kit試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。把不同文庫(kù)按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求pooling后進(jìn)行Illumina測(cè)序, 并產(chǎn)生150bp配對(duì)末端讀數(shù), 測(cè)序片段被高通量測(cè)序儀測(cè)得的圖像數(shù)據(jù)經(jīng)CASAVA堿基識(shí)別轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)。通過(guò)HISAT2 v2.0.5構(gòu)建參考基因組的索引, 將配對(duì)末端clean reads與參考基因組比對(duì)(Kim, 2015, 2019; Pertea, 2016)。參考基因組為實(shí)驗(yàn)室測(cè)得的海洋線蟲(chóng)基因組。featureCounts v1.5.0-p3被用來(lái)計(jì)算映射到每個(gè)基因的讀數(shù)(Liao, 2014)。根據(jù)基因的長(zhǎng)度計(jì)算每個(gè)基因的FPKM, 并計(jì)算映射到該基因的讀數(shù)?；谪?fù)二項(xiàng)分布, 通過(guò)R程序包DESeq2(1.16.1)進(jìn)行兩個(gè)比較組合之間的差異表達(dá)分析(Love, 2014)。使用Benjamini和Hochberg法來(lái)調(diào)整所得P值以控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率。通過(guò)DESeq2篩選出校正后的P值小于0.05(P-adjusted<0.05)的基因被分配為差異表達(dá)基因。顯著差異表達(dá)的篩選標(biāo)準(zhǔn)為校正后的P值<0.05以及|log2foldchange|>1。使用R程序包c(diǎn)lusterProfiler實(shí)現(xiàn)差異表達(dá)基因的GO富集分析和KEGG通路分析, 以校正后的P值小于0.05作為為顯著性富集的閾值(Yu, 2012)。

2 結(jié)果與分析

2.1 海洋線蟲(chóng)L. marina在不同酸性pH條件下的生長(zhǎng)發(fā)育比較

為了探究在不同酸性pH條件下海洋線蟲(chóng).生長(zhǎng)發(fā)育的速度, 我們進(jìn)行了表型實(shí)驗(yàn)。將同步化的70只海洋線蟲(chóng)L1幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到不同pH平板上, 每個(gè)pH條件三次重復(fù), 記錄平板上出現(xiàn)成體的時(shí)間和成體數(shù)量。結(jié)果顯示: 在pH 5.92條件下, 海洋線蟲(chóng).在第4天出現(xiàn)成體, 成體率約為36%, 后續(xù)可以產(chǎn)卵繁殖(圖1); 在pH 5.33條件下, 第4天出現(xiàn)成體, 成體率約為18%, 也可以產(chǎn)卵繁殖(圖1); 在pH 4.33條件下, 第4天線蟲(chóng)不能發(fā)育至成體, 只能長(zhǎng)至L4期幼體, 最終在第6天死亡。在pH 3.33條件下, L1幼蟲(chóng)不能存活, 2h內(nèi)全部死亡。

2.2 海洋線蟲(chóng)L. marina在不同酸性pH條件下的轉(zhuǎn)錄組分析

我們通過(guò)高通量RNA測(cè)序(RNA-seq)來(lái)識(shí)別和量化海洋線蟲(chóng).在不同pH條件下的差異表達(dá)基因。以pH 5.92為對(duì)照組, pH 5.33, pH 4.33分別作為處理組, 錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率FDR<5%和|log2FoldChange|> 1作為差異基因篩選閾值。圖2是差異表達(dá)基因的聚類(lèi)熱圖。各比較組合中上調(diào)基因和下調(diào)基因的數(shù)量如表1所示。

圖1 海洋線蟲(chóng)在不同pH值的成體率

注: 誤差條代表3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)誤差(*<0.05, **<0.01, ***<0.001)

2.3 脂肪酸代謝相關(guān)基因表達(dá)隨pH的下降而升高

通過(guò)KEGG分析, 我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH下降到4.33時(shí), 海洋線蟲(chóng).脂肪酸β-氧化通路涉及的關(guān)鍵酶(Watts, 2017)基因表達(dá)顯著上調(diào)(圖3, 圖4a, 圖4b)。在秀麗線蟲(chóng)中, 對(duì)應(yīng)AMP-binding enzyme注釋的絕大多數(shù)為酰基輔酶A合成酶家族基因(, acyl-CoA Synthetase), 因此在海洋線蟲(chóng).中的這7個(gè)注釋為AMP-binding enzyme的基因極有可能就是表達(dá)?；o酶A合成酶的基因(圖4a)。?；o酶A合成酶可以催化脂肪酸與輔酶A形成硫酯鍵, 形成脂酰-CoA, 這是脂肪酸β-氧化的起始步驟(許雪梅等, 2009; Ellis, 2010)。此外, 隨著pH的下降, 我們還發(fā)現(xiàn)了3個(gè)與不飽和脂肪酸合成相關(guān)的基因的表達(dá)量顯著升高(圖3, 圖4c), 其中EVM0000114屬于ELO家族, 秀麗線蟲(chóng)的脂肪酸延長(zhǎng)酶基因參與了不飽和脂肪酸延長(zhǎng)的主要步驟, 因此海洋線蟲(chóng)EVM0000114基因很有可能也是編碼脂肪酸延長(zhǎng)酶的基因。

表1 每個(gè)比較組合中差異表達(dá)基因的數(shù)量

Tab.1 The number of differentially expressed genes in each combination

圖2 海洋線蟲(chóng)在不同pH值下差異表達(dá)基因的聚類(lèi)熱圖

注: 橫坐標(biāo)為樣品名, 縱坐標(biāo)為差異基因FPKM歸一化后的數(shù)值, 紅色表示上調(diào), 藍(lán)色表示下調(diào)

2.4 表皮相關(guān)基因差異表達(dá)

當(dāng)pH下降到4.33時(shí), 海洋線蟲(chóng).表皮合成相關(guān)的2個(gè)蝦紅素(Astacin)基因和6個(gè)補(bǔ)丁家族基因(Patched family)表達(dá)顯著上調(diào)(圖5a, 5b)。但是, 表皮膠原基因類(lèi)基因的表達(dá)沒(méi)有發(fā)生顯著變化(圖5c)。

2.5 細(xì)胞色素P450通路相關(guān)基因表達(dá)隨pH的下降而升高

在pH 4.33的條件下, KEGG pathway分析結(jié)果顯示, 海洋線蟲(chóng).中細(xì)胞色素P450通路得到顯著富集; 細(xì)胞色素P450氧化酶、黃素結(jié)合的單加氧酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等基因的表達(dá)量都顯著升高(圖3, 圖6)。而在pH 5.33條件下, 細(xì)胞色素P450通路相關(guān)基因中僅EVM0009829、EVM0007061、EVM0012458、EVM0004308、EVM0011078表達(dá)上調(diào)。此外, 海洋線蟲(chóng).核激素受體基因(nuclear hormone receptor)也在pH下降到4.33時(shí)表達(dá)量顯著升高(圖6)。

2.6 凝集素C基因和熱休克蛋白基因的表達(dá)隨pH的下降而上調(diào)

在pH 4.33條件下, 海洋線蟲(chóng).中3個(gè)注釋為HSP70和1個(gè)注釋為HSP90的基因, 以及5個(gè)凝集素C基因的表達(dá)量顯著升高(圖7a, 7b)。但是, 在pH 5.33條件下, 這些基因的表達(dá)量并沒(méi)有發(fā)生顯著變化。

3 討論

3.1 脂肪酸β-氧化可能是海洋線蟲(chóng)響應(yīng)酸性pH脅迫的主要途徑

從分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH下降到4.33時(shí), 25個(gè)脂肪酸β-氧化通路基因表達(dá)顯著上調(diào)(圖4a, 圖4b), 這些基因數(shù)目占鑒定出的所有上調(diào)基因的11%。脂肪酸β-氧化過(guò)程是一個(gè)高度的放能過(guò)程, 每一輪β-氧化會(huì)產(chǎn)生一個(gè)NADH, 1個(gè)FADH2和1個(gè)乙酰-CoA(Houten, 2016), 每個(gè)乙酰-CoA經(jīng)過(guò)氧化可產(chǎn)生10個(gè)ATP(Ashrafi, 2007; Braeckman, 2009; Akram, 2014)。氧化的脂質(zhì)底物可能是在海洋線蟲(chóng).生命早期階段滿足發(fā)育所需能量的主要來(lái)源, 脂肪酸β-氧化通路基因表達(dá)上調(diào), 反映了海洋線蟲(chóng).動(dòng)員能量?jī)?chǔ)備來(lái)應(yīng)對(duì)環(huán)境pH的下降。

pH下降導(dǎo)致的脂肪酸分解代謝增加在不少文獻(xiàn)中都有所報(bào)道。Hall等(2008)的研究發(fā)現(xiàn), 當(dāng)pH從7下降到4, 秀麗線蟲(chóng)3個(gè)脂肪酸β-氧化通路基因表達(dá)量都顯著升高, 包括?；o酶A合成酶(,.), 酰基輔酶A氧化酶(.,.)和3-羥酰輔酶A脫氫酶(,.)基因。該研究認(rèn)為pH下降影響了鈉氫交換體NHX-2耦合H+濃度的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝入, 導(dǎo)致線蟲(chóng)只能通過(guò)脂肪酸的分解來(lái)提供一種替代的能量來(lái)源(Hall, 2008)。與海洋線蟲(chóng).相比, 秀麗線蟲(chóng)脂肪酸β-氧化通路上調(diào)的基因數(shù)量少很多(Cong, 2020), 可見(jiàn)脂肪酸β-氧化雖然參與了秀麗線蟲(chóng)對(duì)酸性脅迫的響應(yīng), 但可能并不發(fā)揮主要作用。紫海膽在海水pH下降時(shí), 脂肪酸氧化途徑中的多個(gè)基因表達(dá)上調(diào)(Evans, 2017), 該研究認(rèn)為酸性脅迫作用于代謝基因網(wǎng)絡(luò), 使ATP轉(zhuǎn)向維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的酸堿平衡, 以此來(lái)增強(qiáng)生物體對(duì)海水酸化的耐受性(Evans, 2017)。

3.2 細(xì)胞色素P450通路基因參與海洋線蟲(chóng)對(duì)酸性pH脅迫的響應(yīng)

細(xì)胞色素P450通路的物質(zhì)代謝過(guò)程主要分為2個(gè)階段。第一階段: 親脂性物質(zhì)被細(xì)胞色素P450單氧化酶(CYP)等修飾成親電或親核物質(zhì)。第二階段: 經(jīng)過(guò)第一階段反應(yīng)產(chǎn)生的親水性化合物在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等的催化作用下與極性配體結(jié)合。最后由ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白把這些性狀改變的化合物運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外(Barnes, 1960; Dieterich, 2008; Croom, 2012)。當(dāng)pH從8.0降到7.3時(shí), 長(zhǎng)牡蠣Cytochrome P450 1A5和Glutathione S-transferase Ω-1表達(dá)量顯著升高(Timmins-Schiffman, 2014)。在本研究中, 當(dāng)pH下降到4.33時(shí), 10個(gè)物質(zhì)代謝細(xì)胞色素P450通路基因表達(dá)顯著上調(diào)(圖3, 圖6)。我們?cè)谛沱惥€蟲(chóng)中也發(fā)現(xiàn), 當(dāng)pH從6.33(秀麗線蟲(chóng)正常培養(yǎng)基的pH)下降到3.13時(shí), 32個(gè)細(xì)胞色素P450 通路基因表達(dá)上調(diào)(Cong, 2020)。秀麗線蟲(chóng)在pH 3.13的條件下依然可以產(chǎn)卵繁殖, 而海洋線蟲(chóng).在pH 4.33的條件下不能長(zhǎng)成成體, 海洋線蟲(chóng)表現(xiàn)得更不耐酸; 我們推測(cè)造成這種差異的原因是海洋線蟲(chóng).基因組中的細(xì)胞色素P450通路基因與陸生自由生活線蟲(chóng)相比, 發(fā)生了顯著縮減(Xie, 2020)。物質(zhì)代謝細(xì)胞色素P450通路基因的啟動(dòng)表達(dá)很可能是為了保護(hù)生物體免受更酸的環(huán)境產(chǎn)生的有毒物質(zhì)的侵害, 或清除因更酸的環(huán)境導(dǎo)致生理狀態(tài)紊亂而積累在其體內(nèi)的有毒物質(zhì)。

圖3 各比較組合中上調(diào)基因的KEGG富集情況

注: 由于下調(diào)基因數(shù)量較少, 所以下調(diào)基因并未被KEGG富集到任何通路中

注: a. 酰基輔酶A合成酶基因的轉(zhuǎn)錄水平; ABE. AMP-binding enzyme, AMP結(jié)合酶; b. 脂肪酸β-氧化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平; CPT. carnitine palmitoyl transferase, 肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶; ACDH. acyl-CoA dehydrogee, ?；o酶A脫氫酶; ACOX. acyl-CoA oxidase, 酰基輔酶A氧化酶; ECH. enoyl CoA hydratase, 烯酰輔酶A水合酶; 3-HACD. 3-hydroxyacyl CoA dehydrogee, 3-羥酰輔酶A脫氫酶; Thiolase. 硫解酶; c. 海洋線蟲(chóng)不飽和脂肪酸合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。ADH. Zinc-binding dehydrogenase, 鋅結(jié)合的脫氫酶; ELO. fatty acid elongase, 脂肪酸延長(zhǎng)酶。倍數(shù)變化表示處理組(pH 4.33, pH 5.33)與對(duì)照組(pH 5.92)的基因表達(dá)量的比值(處理組FPKM值/對(duì)照組FPKM值)。誤差條代表3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。*<0.05, **<0.01, ***<0.001

注: a. 線蟲(chóng)蝦紅素樣金屬蛋白酶基因轉(zhuǎn)錄水平; b. 補(bǔ)丁蛋白相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平; c. 膠原基因的轉(zhuǎn)錄水平。倍數(shù)變化表示處理組(pH 4.33, pH 5.33)與對(duì)照組(pH 5.92)的基因表達(dá)量的比值(處理組FPKM值/對(duì)照組FPKM值)。誤差條代表3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。*<0.05, **<0.01, ***<0.001

圖6 海洋線蟲(chóng)細(xì)胞色素P450通路相關(guān)基因及核激素受體基因的表達(dá)情況

注: CYP. cytochrome P450 oxidase, 細(xì)胞色素P450氧化酶; FMO. Flavin-binding monooxygee, 黃素結(jié)合的單加氧酶; GST. glutathione-S-transferase, 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶; ABC. ATP-binding cassette transporters, ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白; NHR. nuclear hormone receptors, 核激素受體。倍數(shù)變化表示處理組(pH 4.33, pH 5.33)與對(duì)照組(pH 5.92)的基因表達(dá)量的比值(處理組FPKM值/對(duì)照組FPKM值)。誤差條代表3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。*<0.05, **<0.01, ***<0.001

圖7 海洋線蟲(chóng)凝集素C基因(a)和熱休克蛋白基因(b)的表達(dá)情況

注: 倍數(shù)變化表示處理組(pH 4.33, pH 5.33)與對(duì)照組(pH 5.92)的基因表達(dá)量的比值(處理組FPKM值/對(duì)照組FPKM值)。誤差條代表3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。*<0.05, **<0.01, ***<0.001

核激素受體NHRs是參與多種生理過(guò)程的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子, 研究表明NHRs可以調(diào)節(jié)P450通路中Ⅰ期和Ⅱ期解毒基因和、等的表達(dá)(Fisher, 2006), 它在調(diào)節(jié)解毒酶功能方面具有廣泛的底物特異性, 在對(duì)內(nèi)源及外源有毒物質(zhì)的代謝過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用(Hoffmann, 2015), 有毒物質(zhì)很可能通過(guò)配體間接或直接與核激素受體結(jié)合, 然后激活外源物質(zhì)解毒相關(guān)基因的表達(dá)(Lindblom, 2006; Hoffmann, 2015)。

鑒于細(xì)胞色素P450通路基因可能在線蟲(chóng)應(yīng)對(duì)極端酸性環(huán)境脅迫時(shí)可能發(fā)揮的重要作用, 并且該通路基因數(shù)量眾多, 功能復(fù)雜, 本實(shí)驗(yàn)室在今后的研究中會(huì)著重開(kāi)展此通路基因的篩選與鑒定, 通過(guò)大規(guī)模突變體篩選和CRISPR基因編輯技術(shù)探究決定線蟲(chóng)響應(yīng)和適應(yīng)酸性環(huán)境脅迫的關(guān)鍵基因, 以期為生物能夠在不斷變化的pH環(huán)境中生存的分子機(jī)制的理解提供參考, 也可能會(huì)為提高評(píng)估和監(jiān)測(cè)生態(tài)修復(fù)的后果提供新的解決方案。

3.3 表皮相關(guān)基因、凝集素C基因及熱休克蛋白基因共同參與海洋線蟲(chóng)對(duì)酸性pH脅迫的響應(yīng)

在秀麗線蟲(chóng)中,(Nematode Astacin)編碼一種類(lèi)似蝦紅素的金屬蛋白酶(WormBase, 2019), 它與表皮合成密切相關(guān)(Novelli, 2004)。注釋為Patched family的基因在秀麗線蟲(chóng)中絕大多數(shù)都是(ached-elated protein)基因, 這些基因參與了線蟲(chóng)的表皮更替過(guò)程;基因的破壞會(huì)導(dǎo)致秀麗線蟲(chóng)的蛻皮障礙(Zugasti, 2005)。在本研究中,和基因的表達(dá)上調(diào)說(shuō)明表皮相關(guān)基因參與了海洋線蟲(chóng).對(duì)酸性pH脅迫的響應(yīng)我們前期的研究結(jié)果顯示, 當(dāng)pH下降到4.33時(shí), 秀麗線蟲(chóng)中有大量表皮膠原基因表達(dá)上調(diào)(Cong, 2020); 但海洋線蟲(chóng).的基因表達(dá)卻沒(méi)有發(fā)生顯著變化(圖5c), 推測(cè)可能是由于兩種線蟲(chóng)的表皮結(jié)構(gòu)成分不同, 所以對(duì)酸性pH脅迫的響應(yīng)不同。

C型凝集素是一種Ca2+依賴(lài)的糖結(jié)合蛋白(Drickamer, 1989)。當(dāng)海水pH從8.1下降到7.7時(shí), 翼足類(lèi)動(dòng)物的C型凝集素家族基因表達(dá)量也顯著上調(diào)(Maas, 2015), 特別的是, 這些C型凝集素家族基因的功能可能與生物的礦化作用相關(guān)。此外, C型凝集素在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)、免疫防御以及免疫監(jiān)視等生理過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。當(dāng)海水pH從8.1下降到7.7時(shí), 紫貽貝的C型凝集素基因的表達(dá)量也顯著升高, 該研究認(rèn)為海水酸化可能在紫貽貝感染致病菌的早期階段觸發(fā)特定的免疫相關(guān)基因,促進(jìn)抗菌肽和模式識(shí)別受體的轉(zhuǎn)錄(Castillo, 2017)。我們鑒定到的這5個(gè)上調(diào)的C型凝集素基因在海洋線蟲(chóng)對(duì)酸性pH脅迫的響應(yīng)中究竟是發(fā)揮何種功能, 有待于進(jìn)一步研究。

熱休克蛋白作為一種常見(jiàn)的細(xì)胞應(yīng)激的指示蛋白, 在許多刺激下如熱休克、缺氧、重金屬、寒冷、滲透、鹽、紫外線、氧化應(yīng)激和病原體感染等都會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)(Morimoto, 1998; Swindell, 2007)。Urbarova等(2019)的研究發(fā)現(xiàn), ?？诘蚿H環(huán)境條件下, 應(yīng)激相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量急劇增加, 其中非常顯著的就是熱休克蛋白Hsp70和Hsp90的上調(diào)。本研究顯示, 熱休克蛋白家族基因也參與了海洋線蟲(chóng).對(duì)酸性pH脅迫的響應(yīng), 它們發(fā)揮的具體功能有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

我們的研究結(jié)果表明, 當(dāng)pH從5.92下降到4.33時(shí), 海洋線蟲(chóng).通過(guò)大量脂肪酸β-氧化通路基因上調(diào)來(lái)響應(yīng)酸化脅迫, 細(xì)胞色素P450通路基因、凝集素C基因、表皮相關(guān)基因(和)和HSP70家族基因等共同參與響應(yīng)過(guò)程。這些基因的表達(dá)變化與表型實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相吻合, 當(dāng)pH從5.92下降到5.33時(shí), 海洋線蟲(chóng).生長(zhǎng)發(fā)育的速度明顯減慢, 但依然可以產(chǎn)卵繁殖, 上述這些基因的表達(dá)并沒(méi)有發(fā)生顯著變化(只有其中幾個(gè)基因表達(dá)上調(diào)); 而當(dāng)pH下降到4.33時(shí), 海洋線蟲(chóng).則不能長(zhǎng)成成體, 上述這些基因表達(dá)顯著上調(diào)。我們?cè)诤Ｑ缶€蟲(chóng).中發(fā)現(xiàn)的應(yīng)答酸化脅迫的調(diào)控模式, 為理解生物體能夠在低pH環(huán)境中生存的分子機(jī)制提供了參考, 同時(shí)為篩選和識(shí)別生物體響應(yīng)和適應(yīng)酸化脅迫的關(guān)鍵基因奠定了基礎(chǔ)。

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調(diào)查的對(duì)象為杭州市內(nèi)五所高校的在校大學(xué)生群體，五所高校分別浙江工業(yè)大學(xué)、浙江中醫(yī)藥大學(xué)、浙江工商大學(xué)、杭州電子科技大學(xué)、杭州師范大學(xué)。數(shù)據(jù)收集時(shí)間為2018年9月9日至9月25日。調(diào)研過(guò)程共發(fā)放問(wèn)卷350份，收回有效問(wèn)卷336份，問(wèn)卷有效率為96%。問(wèn)卷收集到的信息包括大學(xué)生的基本信息、生活費(fèi)的來(lái)源、對(duì)互聯(lián)網(wǎng)借貸平臺(tái)的認(rèn)知、互聯(lián)網(wǎng)借貸平臺(tái)使用情況等一系列指標(biāo)和信息。

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TRANSCRIPTOME ANALYSIS OF THE RESPONSE OF MARINE NEMATODETO ACIDIC STRESS

CONG Yan-Yi1, 2, 3, 4, XIE Yu-Su1, 2, 3, ZHANG Liu-Suo1, 2, 3

(1. CAS Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, China; 3. Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 4. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Since the industrial revolution, carbon dioxide emissions have led to ocean acidification. The decrease in pH of seawater has important effects on the growth, reproduction, metabolism, and immune regulation of organisms. At present, the molecular mechanisms by which marine organisms perceive and respond to acidic stress remain largely unknown. In this study, marine nematodewas used as an animal model to analyze its phenotypic and transcriptome characteristics under different pH values. Our report provided a reference for exploring the regulatory mechanism of marine invertebrates in response to the acidic stress of seawater. We found that when pH decreased from 5.92 to 5.33 (the optimum growth condition of.is 5.92 in laboratory), the growth and development rate of.decreased significantly, but it could still spawn. In contrast, when pH dropped to 4.33, the growth of.was seriously affected, showing that it could not grow into adulthood and spawn. Through transcriptome analysis, we found that when pH decreased from 5.92 to 4.33, the expression of the fatty acid β-oxidation pathway genes and the unsaturated fatty acid synthesis genes were significantly up-regulated in.. Furthermore, the expressions of 2genes and 6genes were also significantly up-regulated, while the expression level ofgenes were not changed. Additionally, we found that cytochrome P450 pathway genes, lectin C genes and HSP70 family genes were significantly up-regulated. However, when pH decreased from 5.92 to 5.33, most of the above up-regulated genes did not change significantly. This study may lay a foundation for the future study for identifying the master gene(s) responding and adaptation to an acidic stress in nematodes and other marine animals.

marine nematodes;; acidic stress; fatty acid β-oxidation; drug metabolism cytochrome P450

* 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室山東省重大科技創(chuàng)新工程課題, 2018SDKJ0302-1號(hào); 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室 2018年度青年科研人員特別資助項(xiàng)目, 2018.09-2020.08; 青島創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新領(lǐng)軍人才項(xiàng)目, Grant 16-8-3-19-zhc號(hào); 中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心重點(diǎn)部署項(xiàng)目, 2019.11—2022.11。叢巖懿, 碩士研究生, E-mail: congyanyi17@mails.ucas.ac.cn

張留所, 博士生導(dǎo)師, 研究員, E-mail: lzhang@qdio.ac.cn

2020-03-12,

2020-04-18

Q955; K826.15

10.11693/hyhz20200300070