UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS非定向篩查貝類中氮雜螺環(huán)酸毒素及其代謝產(chǎn)物*

吳海燕 陳佳琦 董晨帆, 2 王 松 崔海棟 譚志軍

UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS非定向篩查貝類中氮雜螺環(huán)酸毒素及其代謝產(chǎn)物*

吳海燕1陳佳琦1董晨帆1, 2王 松3崔海棟3譚志軍1①

(1. 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071; 2. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海 201306; 3. 青島衛(wèi)遼醫(yī)用生物材料有限公司 青島 266071)

為了分析復(fù)雜貝類和微藻中的氮雜螺環(huán)酸毒素(AZAs)及其代謝產(chǎn)物, 建立一種基于超高效液相色譜-線性離子阱/靜電場軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜(UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS)聯(lián)用技術(shù)的非定向篩查分析方法。采用Full MS/dd MS2、PRM和Target-SIM/dd MS2三種質(zhì)譜鑒定模式, 整合多種數(shù)據(jù)采集挖掘策略, 通過研究多種AZAs在不同基質(zhì)樣品中的質(zhì)譜裂解規(guī)律及特征碎片離子豐度, 實(shí)現(xiàn)AZAs及其衍生物的快速篩查檢測和精準(zhǔn)鑒別。結(jié)果表明: PRM模式能有效排除AZAs同分異構(gòu)體的干擾, 獲得更高的專屬性, 適用于目標(biāo)代謝物篩查; 應(yīng)用Full MS/dd MS2和PRM結(jié)合的方式, 根據(jù)AZAs裂解途徑及多種AZAs代謝產(chǎn)物裂解規(guī)律, 在貝類中共鑒別出20種AZAs系列化合物, 其中包括初步推測了3種新型AZAs代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。應(yīng)用本方法還發(fā)現(xiàn)AZA9、AZA10、AZA19等代謝物均隨代謝過程持續(xù)升高, 是AZA2在貝類代謝過程中的末端產(chǎn)物。該方法能夠?yàn)閺?fù)雜基質(zhì)中的AZAs系列毒素及其衍生常規(guī)檢測與精準(zhǔn)鑒別提供參考, 可應(yīng)用于解析AZAs毒素在貝類體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化機(jī)制研究。

氮雜螺環(huán)酸毒素; 貝類; 高效液相色譜-線性離子阱/靜電場軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜; 代謝

氮雜螺環(huán)酸毒素(azaspiracids, AZAs)是一類具有獨(dú)特聚醚類螺環(huán)結(jié)構(gòu)(圖1)的脂溶性貝類毒素, 具有毒性強(qiáng)、殘留高且代謝慢等顯著特點(diǎn), 因此成為國際研究熱點(diǎn)和管控重點(diǎn)(EFSA, 2008; Furey, 2010; Hess, 2016; Pelin, 2018)。AZAs主要由環(huán)胺藻(spp.)產(chǎn)生, 通過食物鏈傳遞到海洋貝類中, 并經(jīng)貝類的生物轉(zhuǎn)化作用產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物, 從而對(duì)消費(fèi)者帶來食用安全風(fēng)險(xiǎn)(Hess, 2016)。一般來說, 環(huán)胺藻產(chǎn)生的AZAs組分主要為AZA1、AZA2和AZA3中的一種或兩種(Rossi, 2017;Krock, 2019), 也是毒性最強(qiáng)的三種組分(Pelin, 2018)。最新研究確定產(chǎn)毒藻原生AZA多達(dá)26種(Tillmann, 2017; Krock, 2019), 且經(jīng)過貝類代謝(Jauffrais, 2013; Ji, 2018)后可形成超過50余種的代謝產(chǎn)物(Miles, 2018), 而且部分代謝產(chǎn)物如AZA17和AZA19的毒性較高(Krock, 2015)。貝類中AZAs的組成及其毒性強(qiáng)度總和決定了產(chǎn)品食用安全性, 因此采用高通量AZA及其代謝產(chǎn)物篩查方法進(jìn)行檢測與安全性評(píng)估尤為重要。

圖1 Azaspiracids毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

AZAs的檢測方法包括液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫檢測方法(Samdal, 2015; Leonardo, 2017)等。由于毒素標(biāo)準(zhǔn)品的匱乏, 僅能分析鑒別AZA1—3三種組分, 而多達(dá)40余種的代謝產(chǎn)物尚缺少標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(吳海燕等, 2016)。同時(shí), 貝類制品的基質(zhì)較為復(fù)雜, 目前僅通過前處理過程增加如QuECHERS 技術(shù)(韓深等, 2013)、固相萃取柱等凈化方法, 雖可顯著降低貝類基質(zhì)干擾, 但在代謝物非定向篩查和鑒定中, 仍存在不同程度的基質(zhì)干擾效應(yīng), 給定性鑒別來帶一定困難。近年來, 線性離子阱、靜電場軌道阱以及飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜(韓深等, 2014)在多毒素篩查、代謝產(chǎn)物的發(fā)掘和結(jié)構(gòu)鑒定等方面均有廣泛應(yīng)用。其中, Rehmann等(2008)使用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法確定了AZA12-32的結(jié)構(gòu); 基于高分辨串聯(lián)質(zhì)譜與核磁共振的鑒別技術(shù)也同時(shí)應(yīng)用于新型毒素371鑒定(Rehmann, 2008; Kilcoyne, 2014)、AZA7—9 (Kilcoyne, 2015)、AZA26、AZA33、AZA34和AZA37 (Kilcoyne, 2018)等新型AZAs代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定。但目前的檢測方法較為單一, 主要是限量3種毒素定量方法和單一化合物結(jié)構(gòu)鑒定方法, 缺乏系統(tǒng)的非定向篩查與確證方法。

本研究利用固相萃取凈化前處理, 結(jié)合超高效液相色譜－線性離子阱/靜電場軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜整合全掃描二級(jí)質(zhì)譜模式Full MS/dd MS2、目標(biāo)離子掃描二級(jí)質(zhì)譜模式Target-SIM/dd MS2、平行反應(yīng)監(jiān)測模式PRM模式等多種數(shù)據(jù)采集、挖掘策略快速分析方法, 分析貝類樣品中的AZAs及其代謝產(chǎn)物, 解析質(zhì)譜裂解規(guī)律及特征碎片離子組成, 為研究貝類中AZAs的代謝機(jī)制提供了快速、直觀和準(zhǔn)確的參考方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈(HPLC級(jí), 美國Merk公司); 乙酸銨(HPLC級(jí), 美國Sigma Aldrich公司); 超純水(18.2MΩ·cm); Strata-X固相萃取柱(200mg/6mL, 美國Waters公司), 其他未作特殊說明的試劑均為分析純。AZA1 [CRM-AZA1, (1.24±0.07)g/mL], AZA2 [CRM- AZA2, (1.28±0.05)g/mL], AZA3 [CRM-AZA3, (1.04± 0.04)g/mL]以及AZA陽性基質(zhì)樣品, 其各組分含量分別為AZA1 (1.16μg/g), AZA2 (0.273μg/g)和AZA3 (0.211μg/g), 購自加拿大國家研究理事會(huì)海洋生物科學(xué)研究所。

腹孔環(huán)胺藻()為我國海域分布的AZA產(chǎn)毒藻(Krock, 2014), 具有獨(dú)特的AZA組成(Krock, 2019), 由國家海洋局第三海洋研究所提供。實(shí)驗(yàn)室以f/2培養(yǎng)液單種培養(yǎng), 溫度(20±1)°C, 光照6000lx, 光暗比12h︰12h。經(jīng)檢測該藻主要產(chǎn)生AZA2, 單細(xì)胞產(chǎn)度能力一般為(7.05± 0.52)fg/cell。

櫛孔扇貝()產(chǎn)自青島市膠南靈山灣養(yǎng)殖海域的2齡貝(67mm±8mm)進(jìn)行腹孔環(huán)胺藻(AZA2產(chǎn)毒藻)暴露試驗(yàn)(吳海燕等, 2017), 分別取3、7和22d內(nèi)臟團(tuán)樣品, 均質(zhì)后冷藏于-18°C, 作為AZA代謝實(shí)驗(yàn)樣本。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-線性離子阱/靜電場軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀(UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS): 美國賽默飛世爾公司產(chǎn)品, 配有加熱噴霧離子源(HESI)、Xcalibur 2.1化學(xué)工作站以及Compound discovery 2.1數(shù)據(jù)比對(duì)分析軟件; Dionex UltiMate 3000超高效液相色譜系統(tǒng): 美國賽默飛世爾公司產(chǎn)品, 配有變色龍色譜工作站。Himac CR 22GⅡ高速離心機(jī)(日本Hitachi公司); N-EVAP 112氮吹儀(美國Organomation公司); Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司); 57250-U固相萃取裝置(美國Supelco公司)。

1.3 儀器檢測方法

1.3.1色譜條件 色譜柱: Kinetex XB-C18 (100mm×2.1mm, 2.6μm); 柱溫: 40°C; 流速: 0.30mL/min; 進(jìn)樣量: 5μL; 流動(dòng)相: A為0.15% (/)甲酸水溶液, B為乙腈; 洗脫梯度: 0—7.0min, 20%— 90% B; 90% B持續(xù)3min; 10.0—10.1min, 90%—20% B; 20% B持續(xù)1min。

1.3.2 質(zhì)譜條件 加熱電噴霧離子源(HESI), 正離子模式; 噴霧電壓: 3.5kV; 毛細(xì)管溫度320°C; 加熱器溫度: 50°C; 鞘氣: 40arb; 輔助氣: 5arb;

掃描模式: Full MS/dd MS2與Target-SIM/dd MS2: 采集范圍250—1500; 一級(jí)全掃描(Full MS)分辨率為70000FWHM, C-trap最大容量(AGC target): 5×105, Maximum IT時(shí)間: 100ms; 數(shù)據(jù)依賴二級(jí)子離子掃描(dd-MS2)分辨率為17500FWHM, C-trap最大容量(AGC target): 1×105, C-trap最大注入時(shí)間: 50ms。碰撞能量CE為30、50、70。

平行反應(yīng)監(jiān)測模式PRM模式: 采集范圍250—1500; C-trap最大容量(AGC target): 2×105, Maximum IT時(shí)間: 100ms; 碰撞能量CE為30、50、70。

1.4 樣品制備方法

稱取(2.00±0.02)g樣品, 分別用3 mL甲醇提取3次, 離心后合并上清液, 于40°C氮吹至約1mL, 加入3mL超純水待凈化。依次用1mL甲醇、1mL 30% (/)甲醇水溶液活化Strata-X 固相萃取柱, 然后加入提取液, 再用1mL 20% (/)甲醇水溶液淋洗, 最后用1mL 0.3% (/)氨水甲醇溶液洗脫, 收集洗脫液, 用甲醇定容至1mL過0.22μm濾膜, 上機(jī)分析。

1.5 數(shù)據(jù)采集與處理

本研究運(yùn)用UHPLC-LTQ-Orbitrap MS技術(shù)整合多種數(shù)據(jù)采集、挖掘策略, 對(duì)復(fù)雜貝類基質(zhì)中AZAs及其代謝產(chǎn)物篩查與鑒別。首先, 比較全掃描二級(jí)質(zhì)譜模式Full MS/dd MS2、目標(biāo)離子掃描二級(jí)質(zhì)譜模式Target-SIM/dd MS2、平行反應(yīng)監(jiān)測模式PRM模式采集方法, 確定標(biāo)準(zhǔn)品與基質(zhì)樣品中的裂解規(guī)律和特征碎片; 應(yīng)用Full MS/dd MS2篩查與PRM目標(biāo)鑒定, 結(jié)合精確分子質(zhì)量和文獻(xiàn)信息, 共鑒別出20種具有AZAs母核結(jié)構(gòu)的化合物; 選擇不同質(zhì)量段碎片離子, 通過PRM的子離子掃描模式, 設(shè)置最大分子質(zhì)量誤差為5×10–6, C、H、O 和N原子數(shù)目的范圍分別為20—50、40—80、5—15和1, 實(shí)現(xiàn)了未知代謝產(chǎn)物篩查的功能, 通過高能碰撞(HCD)采集方法, 對(duì)疑似AZAs代謝產(chǎn)物進(jìn)行精細(xì)區(qū)分和結(jié)構(gòu)鑒定。對(duì)確證后的AZA代謝物采用半定量方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品與基質(zhì)樣品中AZAs的質(zhì)譜裂解規(guī)律

在LTQ-Orbitrap MS HESI源電離正離子檢測模式下(分辨率70000), AZA1、AZA2和AZA3的準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+。典型的AZAs的二級(jí)碎片離子特征碎片主要包括: [M+H]+、[M+H-nH2O]+、[M+H-H2O- C9H10O2R1R3]+, 特征離子包括672.4106 (AZA-3658.3954)、462.3214 (AZA-3448.3050)和362.2690等(圖3)。AZAs分子電離產(chǎn)生的最小結(jié)構(gòu)離子碎片為發(fā)生RDA (Retro-Diels-Alder)反應(yīng)的A環(huán)斷裂。除此以外, 其結(jié)構(gòu)中不同碎片均產(chǎn)生脫H2O, 在高能誘導(dǎo)裂解HCD下, 多采用分子離子的脫水峰(18u)作為特征離子, 也可作為定性的判定依據(jù)。在HCD裂解下, MS2圖譜中產(chǎn)生了A、D、E、G環(huán)等碎片離子。其中362.2707的特征碎片結(jié)構(gòu)式為C22H36NO3+(Δ-1.03×10–6)是目前已鑒定結(jié)構(gòu)AZA化合物特有碎片離子(除AZA36和AZA39外)。

由于貝類的基質(zhì)效應(yīng)造成的干擾, 使在實(shí)際檢測過程中造成假陽性現(xiàn)象。研究應(yīng)用多種數(shù)據(jù)采集、挖掘策略, 包括Full MS/dd MS2、PRM和Target- SIM/dd MS2三種鑒定模式, 比較了基質(zhì)溶液中AZAs的質(zhì)譜裂解規(guī)律。其中Full MS/dd MS2能獲得部分主要裂解碎片, 但特異性差。通過建立已知結(jié)構(gòu)的AZAs化合物Inclusion條件, 采用PRM和Target- SIM/dd MS2檢測模式, 在四級(jí)桿過濾掉大量干擾離子提高了靈敏度的同時(shí), 顯著提高二級(jí)高分辨質(zhì)譜選擇性, 靈敏度更佳。比較而言, PRM所獲得離子碎片信息更為豐富, 且響應(yīng)提高1個(gè)數(shù)量級(jí), 貝類基質(zhì)干擾得到有效排除。因此, 采用目標(biāo)篩查PRM AZA基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在不同掃描模式下AZA2的特征碎片(圖2)。

2.2 AZAs代謝產(chǎn)物的快速篩查和鑒別

通過甲醇提取, 固相萃取柱凈化前處理過程, 針對(duì)強(qiáng)殘留能力的脂溶性AZAs代謝物進(jìn)行分離提取。運(yùn)用LTQ-Orbitrap MS儀PRM數(shù)據(jù)采集方法, 比較代謝物的精確分子質(zhì)量、保留時(shí)間以及AZAs二級(jí)碎片離子碎裂規(guī)律與特征碎片對(duì)代謝樣品進(jìn)行快速篩查和鑒定。共鑒別出了20種AZAs代謝產(chǎn)物, 結(jié)果見表1 (化合物1—20)。AZAs代謝產(chǎn)物類型包括分子結(jié)構(gòu)中的C3和C23的羥基化, C8和C22甲基化及羧基化代謝產(chǎn)物(Rehmann, 2008)。結(jié)合色譜保留行為和文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn), 經(jīng)過貝類的代謝作用, 與母體化合物(AZA2)相比, 多種代謝產(chǎn)物的極性增加(Krock, 2015), 在反相色譜柱上的保留時(shí)間提前, 從而在代謝過程中更易于排出體外。

在代謝產(chǎn)物樣品中, 檢測到目標(biāo)858.4998通道, 保留時(shí)間分別為5.51和6.18min的兩種成分, 其高分辨質(zhì)譜中顯示的精確分子離子峰分別為858.5062 (Δ0.62×10–6)和858.5115 (Δ1.36×10–6), 與理論分子量比對(duì)質(zhì)量精度均小于3×10–6, 初步判定為同分異構(gòu)體AZA9和AZA10 (吳海燕等, 2018), 為AZA2在貝類基質(zhì)的代謝中間過程的上游代謝產(chǎn)物。其中, AZA9(RT 5.51min)在R1位發(fā)生羥基化反應(yīng)(圖4), 而AZA10在R4位發(fā)生羥基化反應(yīng), 因此其[M+H-H2O-C9H10O2R1R3]+碎片不同, 分別為658.3991和674.4143, 差值為一個(gè)O(16u)原子。該碎裂模式與AZA9和AZA10結(jié)構(gòu)匹配。

圖2 不同掃描模式下基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中AZA2質(zhì)譜圖

注: a: Full MS/dd MS2模式; b: Target-SIM/dd MS2模式; c: PRM模式

圖3 PRM模式下AZA2質(zhì)譜裂解途徑

已知AZA19為AZA2 R3位發(fā)生羧基化產(chǎn)物, 其分子離子豐度為886.4965 (Δ1.95×10–6), 其A環(huán)斷裂碎片為658.3951 (Δ0.26×10–6); AZA19的R2位發(fā)生去羰基化反應(yīng)后的AZA17, 其A環(huán)斷裂碎片為670.3940 (Δ-1.45×10–6)(圖5)。通過上述裂解規(guī)律分析860.4791通道, 分別在5.17和5.38min有兩個(gè)同分異構(gòu)體化合物, 精確分子離子峰分別為858.5062 (Δ0.62×10–6)和858.5115 (Δ1.36×10–6), 其碎片2的分別為C44H54O4N 660.3935 (Δ-1.82×10–6)和C45H46O5672.4135 (Δ-2.61×10–6)丟失C (12u)碎片, 判定該化合物為AZA13同分異構(gòu)體, 為R1位發(fā)生羧基化反應(yīng)。

716.4727通道中, 保留時(shí)間為6.34min的化學(xué)成分, 其結(jié)構(gòu)中有豐富的去H2O (18u)碎片, 且362.2689碎片與AZAs的C22H36NO3+(Δ- 0.18×10–6),462.3224碎片與AZAs的C27H44NO5+(Δ2.10×10–6)符合AZA的基本的碎裂模式, 將該化合物鑒別為AZA33, 其多級(jí)質(zhì)譜圖及裂解規(guī)律示于圖6。

圖4 m/z 858.4998提取離子流圖和二級(jí)質(zhì)譜圖

注: a: 提取離子流圖; b: RT 5.51化合物二級(jí)質(zhì)譜圖; c: RT 6.18化合物二級(jí)質(zhì)譜圖

圖5 m/z 860.4791提取離子流圖和二級(jí)質(zhì)譜圖

注: a: 提取離子流圖; b: RT 5.17化合物二級(jí)質(zhì)譜圖; c: RT 5.38化合物二級(jí)質(zhì)譜圖

圖6 m/z 716.4727提取離子流圖和二級(jí)質(zhì)譜圖

注: a: 提取離子流圖; b: RT 6.33化合物二級(jí)質(zhì)譜圖

2.3 代謝實(shí)驗(yàn)樣品分析

應(yīng)用Full MS/dd MS2和PRM結(jié)合的方式, 對(duì)AZAs代謝實(shí)驗(yàn)解毒器官——內(nèi)臟團(tuán)樣品(O’Driscoll, 2014)進(jìn)行代謝產(chǎn)物篩查鑒定分析。共鑒別11種AZA代謝產(chǎn)物, 主要成分包括AZA2、AZA6、AZA9、AZA10、AZA11、AZA12、AZA19、AZA23以及3種新型AZAs成分。對(duì)3種新型AZAs成分查閱文獻(xiàn)比對(duì)裂解方式,844.4842初步鑒定為AZA4和AZA5的同分異構(gòu)體, 888.4740為AZA21的同分異構(gòu)體。通過該檢測方法獲得檢測結(jié)果與液相色譜-四極桿/線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜(吳海燕等, 2016)比較, 靈敏度更高, 定性更為精準(zhǔn)。AZA12和AZA19為主要的代謝產(chǎn)物, 在3d代謝樣品中含量比例分別為5.9%和2.6%, 主要以AZA2形式存在(含量為84.0%)。在7d代謝樣品中, 共檢測到9種代謝產(chǎn)物組分, AZA2含量顯著降低, 約為66.9%, AZA12和AZA19含量升高, 含量分別為11.5%和9.8%。至代謝22d樣品中, 檢出全部11種代謝產(chǎn)物。其中部分代謝產(chǎn)物如AZA9, AZA10, AZA19均隨代謝過程持續(xù)升高, 是AZA2在貝類代謝過程中的末端產(chǎn)物。因此, 應(yīng)用本方法對(duì)促進(jìn)AZAs的代謝進(jìn)程具有重要的作用。

表1 貝類基質(zhì)中AZA代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜裂解信息及鑒定

Tab.1 Characterization of AZA metabolites in the shellfish

綜上可見, 脂溶性AZAs在貝類基質(zhì)體內(nèi), 以多種代謝物形式進(jìn)行代謝轉(zhuǎn)化, 代謝產(chǎn)物極性增加, 當(dāng)殘留能力較強(qiáng), 可長時(shí)間殘留在基質(zhì)樣品中。由于目前多種AZAs代謝產(chǎn)物的毒性當(dāng)量因子未知, 因此整體增加貝類對(duì)消費(fèi)者食用安全的風(fēng)險(xiǎn)性, 需加以重視。

3 結(jié)論

本研究采用UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS高分辨質(zhì)譜技術(shù)建立了多種數(shù)據(jù)采集模式、挖掘策略用于AZAs及其代謝物質(zhì)的精準(zhǔn)篩查。分析比較標(biāo)準(zhǔn)品和基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì), 共獲得20種AZAs系列化合物二級(jí)碎片信息, 初步推測了3種新型AZAs代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。應(yīng)用該方法分析AZA2在貝類中的代謝輪廓, 共檢測出11種AZAs, 其中AZA12和AZA19為主要的代謝上游產(chǎn)物。該方法能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中的AZAs的精準(zhǔn)鑒別, 可為AZA的代謝機(jī)理研究提供參考。

表2 扇貝代謝實(shí)驗(yàn)樣品AZAs組成及含量

注: 用AZA2標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行相對(duì)定量

吳海燕, 李清云, 邴曉菲等, 2017. 氮雜螺環(huán)酸毒素在櫛孔扇貝體內(nèi)的代謝規(guī)律. 中國水產(chǎn)科學(xué), 24(6): 1298—1306

吳海燕, 郭萌萌, 鄭關(guān)超等, 2018. 氮雜螺環(huán)酸毒素的生態(tài)分布、蓄積代謝與檢測技術(shù)監(jiān)控研究進(jìn)展. 中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn), 8(1): 7—15

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UNTRAGETED SCREENING OF AZASPIRACIDS AND ITS METABOLITES IN SHELLFISH AND TOXIN PRODUCING ALGAE BY UHPLC-LTQ-ORBITRAP

WU Hai-Yan1, CHEN Jia-Qi1, DONG Chen-Fan1, 2, WANG Song3, CUI Hai-Dong3, TAN Zhi-Jun1

(1. Key Laboratory of Testing and Evaluation for Aquatic Product Safety and Quality, Ministry of Agriculture; Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China; 2. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3.Qingdao Value & Value Medical Biomaterial Co., Ltd, Qingdao 266071, China)

Azaspiracids (AZAs), one kind of lipid-soluble shellfish toxins, with the lowest provisional acute reference dose (ARfD) and relative high toxicity among all kinds of shellfish toxins, are easily accumulated to high levels in shellfish and can persist for long periods. Consumption of AZAs contaminated shellfish could cause severe acute gastrointestinal poisoning, posing threats to public health, and concerns on quality of shellfish products. In recent years, AZAs contamination has become a worldwide problem. AZAs producing microalgae are extensively distributed around the coasts of China, resulting in increased AZAs accumulation in shellfish. It is therefore necessary to assess the potential risk of AZAs in shellfish. However, the mechanism for AZAs detoxification in human remains poorly documented, and often generates inaccurate safety assessments. In this study, ultra-high-performance liquid chromatography linear ion trap/orbitrap high-resolution mass spectrometry (UHPLC-LTQ-Orbitrap) was used to integrate the untargeted screening analysis method of AZAs and its metabolites in shellfish. The mass spectrum characterization of AZA standard solution and positive matrix samples was analyzed for routine detection and accurate identification in three identification modes: Full MS/dd MS2, PRM, and target-SIM /dd MS2. The results show that PRM could effectively eliminate the interference of isomers and obtain higher specificity. Non-target high-throughput screening analysis by Full MS/dd MS2and the PRM were conducted for metabolic samples. Twenty AZA species and three new AZA metabolites were identified from various samples. Therefore, this method can provide a reference for accurate routine detection of AZAs in complex matrixes and for studying the metabolic transformation mechanism.

azaspiracid; shellfish toxin; ultra-high-performance liquid chromatography linear ion trap/orbitrap high-resolution mass spectrometry (UHPLC-LTQ-Orbitrap); metabolite

* 國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助, 2017YFF0211103號(hào); 國家自然科學(xué)基金, 41806138號(hào)。吳海燕, 助理研究員, E-mail: wuhy@ysfri. ac.cn

譚志軍, 博士生導(dǎo)師, 研究員, E-mail: tanzj@ysfri.ac.cn

2020-03-06,

2020-04-23

O656.22

10.11693/hyhz20200300057