棘胸蛙歪頭病的病原分離鑒定與防治試驗

棘胸蛙(Quasipaa spinosa)俗稱石蛙、石雞等，屬蛙科、棘蛙屬，其棲息地主要分布在我國南方各省的密林溪澗中。棘胸蛙肉質(zhì)細嫩、味道鮮美，同時具有很高的藥用價值，深受消費者的喜愛。隨著自然資源量的下降，被世界自然保護聯(lián)盟(IUCN)列為易危(VU)保護等級，是浙江省的重點陸生野生保護動物。人工養(yǎng)殖是促進棘胸蛙資源恢復(fù)和保護的重要舉措，2020 年國家出臺政策將棘胸蛙劃歸漁業(yè)部門按水生動物管理，其人工養(yǎng)殖也將會進入快速發(fā)展期。

在棘胸蛙養(yǎng)殖過程中，病害問題是制約其發(fā)展的瓶頸。尤其是一種以病蛙頭部歪斜、白內(nèi)障或藍眼、在水中打轉(zhuǎn)等癥狀的歪頭病，因發(fā)病率、死亡率高，給養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的經(jīng)濟損失。棘胸蛙歪頭病的病原鑒定多為腦膜炎敗血伊麗莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica)，但是，我們在2020 年對發(fā)病棘胸蛙歪頭病的病原分離中發(fā)現(xiàn)主要病原為弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)，結(jié)合攻毒試驗表明，弗氏檸檬酸桿菌也能復(fù)制出歪頭癥狀。我們對該病原進行了藥物敏感性試驗和室外治療試驗，以期為棘胸蛙養(yǎng)殖中該病的診斷與防治提供參考。

一、棘胸蛙歪頭病癥狀

棘胸蛙歪頭病在整個養(yǎng)殖季節(jié)都有發(fā)生，主要在6－8月。2020年8月2日我們從浙江遂昌獲得病蛙，主要表現(xiàn)為頭部歪斜、眼睛發(fā)白或出現(xiàn)藍眼，解剖發(fā)現(xiàn)肝臟發(fā)黑、脾臟腫大、腸壁變薄透明、腸道空、腸內(nèi)有少量淡黃色黏液(圖1)。

圖1 病蛙頭部及解剖癥狀

二、病原分離鑒定

1.分離 將患病棘胸蛙進行剖檢，無菌操作取肝、脾、腎、腦組織劃線接種在大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(TSA)上，挑取單菌落28℃下進行純化培養(yǎng)18～24小時，觀察菌落及細菌形態(tài)特征。

2.攻毒 將獲得的優(yōu)勢純化菌株接種于TSA平板，28℃恒溫培養(yǎng)24 小時，用0.8%的無菌生理鹽水洗下，麥氏比濁法將細菌濃度調(diào)整為每毫升1.0×107CFU。健康棘胸蛙室內(nèi)暫養(yǎng)5 天后，每只腹腔注射0.2 毫升，共10 只，對照組注射等量生理鹽水。接種后每天觀察棘胸蛙的臨床癥狀和死亡情況，連續(xù)觀察14天。

3.生理生化鑒定 生理生化鑒定采用梅里埃VITEK2 compact微生物全自動鑒定系統(tǒng)。

4.分子鑒定 采用TaKaRa 公司的16S rDNAPCR 擴增試劑盒提取菌株的DNA，采用擴增細菌的PCR通用引物，正向引物F：5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇，反向引物R：5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇。PCR 擴增反應(yīng)條件：25 微升反應(yīng)體系，每管依次加入10 微升Taq 酶、上下游引物各1 微升，模板1 微升，加超純水10 微升。反應(yīng)程序：94℃變性1 分鐘，54℃退火1 分鐘，72℃延伸1 分鐘，30 個循環(huán)；72℃終延伸7 分鐘。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物。PCR 擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，測序結(jié)果與GenBank中已知核酸序列進行BLAST比對分析。

三、防控試驗

防控試驗選擇敏感藥物恩諾沙星，結(jié)合解毒促代謝和增強免疫的中藥制劑應(yīng)激寧、銀黃可溶性粉、黃芪多糖進行內(nèi)服治療5～7 天。外用消毒藥物選擇以刺激性小的大黃流浸膏和復(fù)合碘混合液0.3毫克/升，每天1次，連用3次。

四、結(jié)果

1.病原鑒定 經(jīng)對分離的優(yōu)勢菌進行攻毒試驗，健康棘胸蛙7天內(nèi)都發(fā)病死亡，其中有部分出現(xiàn)歪頭、白內(nèi)障等癥狀，但50%的發(fā)病死亡蛙未見明顯癥狀。對致病菌進行形態(tài)特征觀察，該菌落呈乳白色、不透明或半透明、凸起、邊緣光滑整齊，恒溫培養(yǎng)24 小時后菌落直徑為1.0～3.0 毫米。經(jīng)生理生化與分子鑒定，確定為弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)。

2.藥敏試驗 致病菌的藥物敏感試驗結(jié)果表明，該菌株對恩諾沙星、氟苯尼考、強力霉素高敏，對紅霉素、新霉素中敏，對SMZ、青霉素、慶大霉素、頭孢Ⅳ、利福平等耐藥。

3.防控效果 8 月4 日開始，將10%恩諾沙星4克＋應(yīng)激寧8克＋銀黃可溶性粉2 克＋黃芪多糖0.5 克拌加1 千克黃粉蟲，連續(xù)內(nèi)服5 天，其中恩諾沙星為3 天；外用大黃流浸膏和復(fù)合碘混合液0.3 毫克/升，每天1 次，連續(xù)3 天；對投料區(qū)也進行潑灑消毒。8 月4 日當(dāng)天死亡258 只，8 月 5 日 死 亡 220 只 ， 8 月 6 日 死 亡115 只，8 月 7 日死亡 84 只 ，8 月 8 日死亡12只，8月10日以后未見死亡病蛙，顯示較好的治療效果。

五、小結(jié)

棘胸蛙歪頭病是棘胸蛙、黑斑蛙、牛蛙養(yǎng)殖中的常見病害，病原鑒定比較統(tǒng)一的是腦膜炎敗血伊麗莎白菌，但不排除歪頭為一種癥狀、多種病原引起。從實驗室對不同來源的歪頭病例檢測發(fā)現(xiàn)，6－7 月送檢的黑斑蛙歪頭病還帶有較為明顯的腎臟囊腫，而8月送檢的歪頭病蛙則囊腫不明顯，也顯示出不一樣的病理特征。

弗氏檸檬酸桿菌過去常常被認為是腸道致病菌，近年來發(fā)現(xiàn)，毒力較強的菌株可能穿過腸道黏膜，進而在全身擴散傳播，引起機體系統(tǒng)感染，而不僅僅局限于腸道感染?；疾〖赝苣c壁變薄、腸道黏膜免疫系統(tǒng)受損，可能促使了該病的發(fā)生。近年來，肝腸損傷導(dǎo)致的疾病非常普遍，在魚類、兩棲類報道較多，因此，我們考慮肝腸代謝問題可能是該病發(fā)生的一個關(guān)鍵誘因。由于棘胸蛙投喂的黃粉蟲脂肪含量高，在水溫適宜、投喂量加大以后，造成腸道和肝臟負荷增大，產(chǎn)生的大量自由基氧化造成腸黏膜和肝損傷，導(dǎo)致腸道變薄和肝臟顏色發(fā)黑等癥狀，機體的抗應(yīng)激和免疫機能下降，從而促進各種病原微生物的感染。在治療過程中添加應(yīng)激寧和免疫多糖，可以緩解自由基損傷、增強機體免疫功能，并對腸壁修復(fù)有一定的效果。實踐表明，控制投料、保持料臺清潔、定期用中草藥消毒劑消毒，該病害的發(fā)生就少，即使發(fā)病治療的效果也較好。