近紅外光促脂質(zhì)體釋藥及光熱治療

龔玲俐 劉 含 陸 爽 王慧敏 范於菟 陳永盛 楊昌英

(三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院， 湖北 宜昌 443002)

脂質(zhì)體因其與細(xì)胞膜的相似性和顯著的載藥轉(zhuǎn)運(yùn)能力而引起廣泛關(guān)注[1]．脂質(zhì)體載藥適用于水/油溶性藥物，可提高藥物生物利用度、溶解性，實(shí)現(xiàn)延長藥物循環(huán)，降低藥物毒性[2]．近年來，新型多功能脂質(zhì)體的開發(fā)成為熱點(diǎn)，如復(fù)合高分子[3]，表面修飾等[4]．金納米簇(AuNCs)是一類直徑2～10 nm左右的金粒子，通常由幾十個金原子組成[5]．近年來，AuNCs因其具有合成方便、熒光性能突出、光學(xué)/膠體穩(wěn)定性好、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)而作為探針或藥物運(yùn)載工具[6-8]．AuNCs能夠在高強(qiáng)度激光下長時間成像，其吸收和散射截面通常比有機(jī)染料大5～6個數(shù)量級[9]．同時，AuNCs具有光熱轉(zhuǎn)換能力，近紅外激光照射下溫度升高，可用于腫瘤的光熱治療(PTT)[10]．

本文以牛血清蛋白(BSA)為模板，37℃溫和反應(yīng)，制備得到AuNCs，透析至中性，作為水化介質(zhì)，原位制備載藥脂質(zhì)體．磷脂選用卵磷脂(EPC)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-mPEG-2000)，藥物選用香豆素6(C6)，形成AuNCs雜化載藥脂質(zhì)體Lips/C6@AuNCs，利用AuNCs的光熱效應(yīng)實(shí)現(xiàn)藥物光控釋放．進(jìn)一步對脂質(zhì)體表面進(jìn)行修飾，如腫瘤靶向因子葉酸(FA)、谷胱甘肽(GSH)，緩釋成分葡甘露聚糖(KGM)，達(dá)到靶向釋藥和長循環(huán)，提高脂質(zhì)體藥物的生物利用度．合成路線及作用原理如圖1所示．

圖1 Lips/C6@AuNCs制備路線示意圖

1 試劑和儀器

蛋黃卵磷脂(EPC，純度≥40%)、膽固醇(CH)和小牛血清蛋白(BSA，IV)購于Sigma公司，DSPE-mPEG-2000購于西安瑞禧，魔芋葡甘露聚糖(KGM)來自湖北一致魔芋公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純．

吸收光譜和熒光光譜測試分別在UV-2600紫外分光光度計(jì)(日本島津)和FL-4600熒光分光光度計(jì)(日本日立)上進(jìn)行；粒徑和Zeta電位使用ZS-90粒度電位儀(英國馬爾文)測試；光熱實(shí)驗(yàn)選用808 nm激光燈(長春鐳銳)；AuNCs與Lips/C6@AuNCs形態(tài)用F200場發(fā)射高分辨透射電子顯微鏡(日本電子)觀測；體系溫度變化以便攜式高精度溫度計(jì)監(jiān)測(美國，Omega)．

2 實(shí)驗(yàn)過程

2.1 AuNCs的制備

采用模板法制備AuNCs．稱量0.375 g BSA溶解于5 mL PBS緩沖溶液(pH=7.4， 0.2 mM)，在4℃冰箱放置12 h后使用．向BSA溶液中緩慢加入0.5 mL HAuCl4溶液(0.1 M)，混合2 min后，加入0.7 mL 1.0 M的氫氧化鈉，于37℃劇烈攪拌12 h．得到的溶液8 000 rpm/min離心除去不溶性雜質(zhì)，在PBS介質(zhì)中透析4 h以上(8 000～14 000 Da，美國)除去NaOH等小分子，得到AuNCs，呈中性．

2.2 Lips/C6的制備

采用薄膜水化-超聲法制備裝載C6的脂質(zhì)體Lips/C6．以EPC∶DSPE-mPEG-2000∶CH∶C6=10∶2∶1∶1的質(zhì)量比稱取所需試劑共計(jì)21 mg，完全溶解于3 mL的氯仿溶液后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)形成磷脂薄膜，45℃的真空干燥過夜除盡溶劑．加入5 mL PBS緩沖溶液，45℃溫育30 min，渦旋混勻5 min后在0～4℃冰水浴間斷超聲15 min(功率400 W)，4 000 rpm/min離心除去游離的C6，得到Lips/C6．

2.3 Lips/C6@AuNCs的制備

磷脂薄膜的制備方法同上，以5 mL的AuNCs分散液代替PBS緩沖，溫育磷脂薄膜，超聲，離心，得到Lips/C6@AuNCs．

2.4 Lips/C6@AuNCs表面修飾

分別配置0.1 M谷胱甘肽(GSH)，0.023 M葉酸(FA)(以EDC活化過)，0.5wt% KGM水溶液．與上述Lips/C6@AuNCs體系以體積比1∶1混合避光磁力中速攪拌2 h，即可分別得到Lips/C6@AuNCs-KGM，Lips/C6@AuNCs-GSH，Lips/C6@AuNCs-FA體系．

2.5 Lips/C6@AuNCs形態(tài)觀測

利用高分辨透射電鏡觀測AuNCs與Lips/C6@AuNCs的表觀形態(tài)，體系溶液分散均勻，稀釋10倍，將樣品涂布于直徑4 mm銅網(wǎng)上，自然風(fēng)干，抽真空15 min除去表面懸浮雜質(zhì)，進(jìn)行觀測．

2.6 光譜測試

光譜測試均使用1 cm四通石英比色皿，C6和AuNCs吸收光譜分別以甲醇和水為參比，掃描范圍：200～800 nm. AuNCs的熒光發(fā)射光譜測試時，激發(fā)波長設(shè)置為380 nm，發(fā)射波長掃描范圍：400～700 nm，狹縫5.0 nm，電壓700 mV．除了探討熒光強(qiáng)度與溫度的關(guān)系實(shí)驗(yàn)外，光譜測試均在室溫下進(jìn)行．

2.7 C6包封率

配制質(zhì)量濃度分別為1.0，2.0，4.0，8.0，16.0和32.0 μg/mL的C6甲醇溶液，利用紫外-可見分光光度計(jì)測定450 nm處的最大吸收值，作出C6的紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線．離心收集脂質(zhì)體系中游離的C6，溶于甲醇，測定吸收值，根據(jù)公式(1)計(jì)算包載率EE：

(1)

其中：wf，wt分別指游離C6的質(zhì)量和C6的總量．

2.8 光熱效應(yīng)

采用808 nm激光發(fā)射器作為光源(功率密度2.5 W/cm2)，分別垂直照射定量體積且呈液體狀態(tài)的AuNCs、Lips/C6、Lips/C6@AuNCs、Lips/C6@AuNCs-KGM、Lips/C6@AuNCs-GSH、Lips/C6@AuNCs-FA體系10 min，記錄體系的實(shí)時溫度，連續(xù)讀數(shù)，時間間隔為10 s，繪制溫度變化曲線．

以照射10 min后自然冷卻為一個光熱效應(yīng)測試循環(huán)，往復(fù)4個循環(huán)，根據(jù)溫度變化曲線，測定各體系的光熱效應(yīng)穩(wěn)定性．

2.9 藥物溶出實(shí)驗(yàn)

為了探究Lips/C6@AuNCs體系是否具有光促進(jìn)藥物釋放的特性，利用透析膜(截留分子量8 kD)模擬藥物溶出，并設(shè)置近紅外光促釋放實(shí)驗(yàn)組，光源為波長808 nm激光(功率1 W/cm2)，pH 7.4 PBS緩沖溶液為釋藥介質(zhì)，體系溫度37℃，光照組局部溫度略高，溶出總時長36 h，定時定點(diǎn)取樣，處理樣品，光譜測試，計(jì)算溶出度，繪制溶出曲線．AuNCs的光熱轉(zhuǎn)換能力使得脂質(zhì)體雙膜破裂，藥物快速地釋放，病變部位藥物濃度急劇升高，可達(dá)到較好的治療效果．另外，Lips/C6@AuNCs-KGM體系有對于脂質(zhì)體膜表面的對抗血流剪切應(yīng)力的保護(hù)作用，以及增強(qiáng)長循環(huán)作用，減少對藥物運(yùn)輸中的泄露，將藥物盡可能多的運(yùn)輸?shù)讲∽儾课?，治療效果更佳．Lips/C6@AuNCs-FA體系具有靶向腫瘤的功能，藥物主動運(yùn)輸至腫瘤部位，減少對健康細(xì)胞的損害，提高藥物生物利用度，增強(qiáng)抗癌效果．

2.10 體外細(xì)胞毒性及光熱治療

為了在體外檢測Lips/C6@AuNCs體系的細(xì)胞毒性，選擇人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞作為典型腫瘤細(xì)胞，定期進(jìn)行相應(yīng)的細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)．采用3-[4，5-二甲基噻唑-2]-2，5-二苯基四氮咗溴鹽(MTT)測定游離香豆素6、AuNCs的細(xì)胞毒性以及808 nm激光源處理的AuNCs、Lips/C6、Lips/C6@AuNCs體系的細(xì)胞毒性．將1×104個HepG2細(xì)胞鋪在96孔板上孵化于DMEM標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(美國Gibco)，含有10wt%胎牛血清(四季青)和1wt%青鏈霉素混合雙抗(美國Solarbio)，在5%二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)24 h，然后分別加入游離香豆素6、AuNCs、Lips/C6、Lips/C6@AuNCs體系，細(xì)胞溶液中的濃度分別設(shè)置為0、12.5、25、50、100、200 nmol/mL，繼續(xù)孵育48 h．再向每孔加入10 μL的MTT(5 mg/mL)，孵育4 h．最后，小心除去細(xì)胞培養(yǎng)液，并加入150 μL的二甲基亞砜(DMSO)溶解晶體，室溫下輕柔振蕩5 min，用酶標(biāo)儀記錄在490 nm下的吸收光譜．所有實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行5次，每個結(jié)果取平均值．808 nm光源處理的樣品濃度為200 nmol/mL，功率為2.0 W/cm2，每孔照射時長為5 min．其他實(shí)驗(yàn)步驟與上述一致．

3 結(jié)果與討論

本研究按照如圖1所示路線合成組裝得到Lips/C6@AuNCs體系，并進(jìn)一步修飾脂質(zhì)雙膜，靶向運(yùn)輸至腫瘤部位，808 nm近紅外光透皮釋藥，治愈病變部位．

3.1 Lips/C6@AuNCs形態(tài)

利用日本電子捷歐路JEM-F200高分辨透射電鏡觀測AuNCs的外觀，如圖2a，圖中有數(shù)個黑色小顆粒，推測為幾十個金原子圖案簇在一起形成的顆粒，即為AuNCs，尺寸約2 nm，這與文獻(xiàn)[1]中所報道的以牛血清蛋白為模板的尺寸一致．圖2b為透射電鏡拍攝Lips/C6@AuNCs的外觀，可觀察到顆粒內(nèi)部存在一個黑色的球心內(nèi)腔，其外部包裹一層不透明薄膜，尺寸約為120 nm左右．脂質(zhì)體是磷脂分子親水頭部暴露于水相，疏水尾部聚集在一起避開水相，形成具有雙分子層結(jié)構(gòu)的封閉囊泡．根據(jù)透射電鏡圖像，進(jìn)一步推測Lips/C6@AuNCs體系的組裝方式，作為緩沖溶液的AuNCs包裹于脂質(zhì)體中心水腔，疏水性的C6封裝于脂質(zhì)體疏水雙分子層中，這與預(yù)想的組裝方式一致．

根據(jù)2.5方法得到C6吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.163 6CC6+0.064 46(R2=0.999 2)．根據(jù)包封率計(jì)算公式分別得到Lips/C6包封率95.02%，Lips/C6@AuNCs包封率為61.22%，可見雜化體系仍保持較高的載藥率．

圖2 高分辨透射電鏡下的AuNCs(a)和Lips/C6@AuNCs(b)

3.2 Lips/C6@AuNCs吸收、發(fā)射光譜

利用紫外-可見光譜儀和熒光光譜儀測定AuNCs和Lips/C6@AuNCs體系的吸收發(fā)射光譜．如圖3a，AuNCs在560 nm處有一個寬吸收峰，在近紅外一區(qū)950 nm處有小的吸收，理論上說明AuNCs具有光熱效應(yīng)；以波長380 nm激發(fā)，掃描得到熒光光譜，AuNCs發(fā)射強(qiáng)烈的紅色熒光，最大發(fā)射波長為670 nm左右．如圖2b，Lips/C6@AuNCs的吸收光譜由于C6的吸收使得體系在600 nm以下吸收值變大，但在近紅外一區(qū)的吸收不變；同樣的條件激發(fā)，Lips/C6@AuNCs顯示兩個發(fā)射峰，510 nm處是C6的發(fā)射峰，而此時AuNCs的吸收紅移至800 nm，說明體系內(nèi)發(fā)生了熒光共振能量轉(zhuǎn)移，間接證明體系構(gòu)建成功．

圖3 AuNCs和Lips/C6@AuNCs體系紫外吸收、熒光發(fā)射光譜

3.3 Lips/C6@AuNCs粒徑電位表征

利用粒徑電位分析表征Lips/C6@AuNCs體系的表面修飾情況見表1．

表1 不同體系粒徑與Zeta電位

Lips/C6@AuNCs粒徑相比Lips/C6粒徑變化不大，均為120 nm左右，說明封裝AuNCs并不影響脂質(zhì)體顆粒大??；Lip/C6與AuNCs的Zeta電位分別為-3.01 mV和-17.2 mV，兩者組裝之后的Zeta電位增大至-37.0 mV，ζ電位數(shù)值越大，反映體系越穩(wěn)定，AuNCs雜化脂質(zhì)體體系電位達(dá)到-30mV以上，穩(wěn)定性一般；相比于電位±5 mV以下，易于凝結(jié)的Lips/C6體系，該體系穩(wěn)定性增強(qiáng)．由于GSH和FA都是小分子化合物，Lips/C6@AuNCs-GSH和Lips/C6@AuNCs-FA體系粒徑幾乎不變，但Zeta電位變化明顯．GSH是一種含γ-酰胺鍵和巰基的三肽，其巰基與Lips/C6@AuNCs體系A(chǔ)uNCs作用，端基酰胺鍵帶正電，與測得Zeta電位為+19.7 mV結(jié)果一致．利用羧基活化試劑碳二亞胺鹽酸鹽將FA末端羧基活化，另一端帶正電氨基與帶負(fù)電的Lips/C6@AuNCs作用，而FA末端的羧基顯負(fù)電，這與測試結(jié)果-32.3 mV電荷一致．KGM是糖基末端連接一個乙?；鶊F(tuán)的中性多糖，具有促進(jìn)免疫功能的功效，本身耐受性好，不容易被機(jī)體消化吸收，使Lips/C6@AuNCs-KGM體系實(shí)現(xiàn)延長藥物循環(huán)和結(jié)腸定點(diǎn)釋放的功能．它與脂質(zhì)體之間有一定的弱相互作用，通過磁力攪拌使兩者結(jié)合．測試結(jié)果顯示體系粒徑增大至(238.05±6.45) nm，Zeta電位降低至-26.2 mV．

3.4 Lips/C6@AuNC光熱效應(yīng)

利用近紅外光源發(fā)射器和Omega便攜式高精度溫度計(jì)測定Lips/C6@AuNCs體系的光轉(zhuǎn)化成熱的能力．近紅外光源波長為808 nm，激光功率為2.5 W/cm2，測試溶液體積規(guī)定為1 mL，照射時長均為600 s，測試結(jié)果如圖4所示．圖4a為Lips/C6、AuNCs和Lips/C6@AuNCs三者近紅外光照射后的溫度變化曲線，AuNCs的溫度變化最明顯，10 min由25℃上升到72.9℃；Lips/C6@AuNCs其次，溫度上升至59.9℃；而同樣的條件Lips/C6僅上升14.8℃．可見，AuNCs光熱轉(zhuǎn)化效率高，雜化到脂質(zhì)體中，仍然可以保持較好的光熱效應(yīng)．光照射下，脂質(zhì)體溫度升高，流動性加大，有望實(shí)現(xiàn)藥物加速釋放．Lips/C6@AuNCs-KGM、Lips/C6@AuNCs-GSH、Lips/C6@AuNCs-FA的光熱效應(yīng)測試結(jié)果如圖4b，揭示表面修飾并不影響體系的光熱效應(yīng)，所有體系均有良好的光熱轉(zhuǎn)化效率．

圖4 808 nm照射下，(a)Lips/C6、AuNCs、Lips/C6@AuNCs溫度變化圖;(b)Lips/C6@AuNCs、Lips/C6@AuNCs-GSH、Lips/C6@AuNCs-FA、Lips/C6@AuNCs-KGM溫度變化

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Lips/C6@AuNCs光熱轉(zhuǎn)化穩(wěn)定性良好，如圖5所示，體系光照升溫，冷卻后再光照，體系在同一時間周期，溫度上升幅度不下降，4個循環(huán)后，體系Lips/C6@AuNCs仍保持良好的光熱活性，說明光照升溫不會破壞體系結(jié)構(gòu)，可逆性和重復(fù)性好．

3.5 Lips/C6@AuNCs體系熒光強(qiáng)度與溫度的關(guān)系

探究了溫度對Lips/C6@AuNCs體系的影響，主要測定了其熒光發(fā)光的情況．將AuNCs和Lips/C6@AuNCs體系分別從15℃加熱至60℃，以15℃的熒光強(qiáng)度為基礎(chǔ)強(qiáng)度，計(jì)算其他不同溫度下的相對熒光強(qiáng)度，作出以I/I0與溫度的關(guān)系圖(如圖6所示)．圖中Lips/C6@AuNCs的熒光強(qiáng)度隨溫度的升高而下降，并呈線性相關(guān)，這一特性可將AuNCs作為熒光探針應(yīng)用于分析細(xì)胞內(nèi)線粒體[11]溫度，高溫對于靶向腫瘤治療具有深遠(yuǎn)意義，Lips/C6@AuNCs體系有實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)溫度可控腫瘤光熱治療的潛能；AuNCs熒光發(fā)光能力減弱同時發(fā)熱性能增強(qiáng)，所以一定條件下，溫度越高，Lips/C6@AuNCs體系光轉(zhuǎn)化熱的效率越高．

圖6 Lips/C6@AuNCs體系熒光強(qiáng)度隨溫度變化圖

3.6 體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)

利用透析法模擬體外釋放試驗(yàn)，設(shè)置近紅外光照組和無光照組進(jìn)行對照，透析袋內(nèi)為待釋放樣品，近紅外光直接照射樣品，藥物釋放環(huán)境為pH 7.4 PBS緩沖溶液，每間隔一定時間取樣一次，測定藥物釋放量，繪制累積釋放藥物百分比與時間的關(guān)系曲線(如圖7所示)．圖7(a)是Lips/C6@AuNCs體系的光促釋放圖，溶出36 h，無光照組累積藥物釋放率僅為49.93%，而近紅外光照組達(dá)到85.42%，釋放率明顯高于無光照組，可見，AuNCs雜化體系光促釋放效應(yīng)明顯．事實(shí)上，AuNCs本身的光熱效應(yīng)還可實(shí)施光熱殺死腫瘤細(xì)胞，達(dá)到光促釋藥和光熱治療的協(xié)同效果．圖7(b)是Lips/C6@AuNCs-KGM體系藥物釋放曲線，總體上看，由于KGM的修飾，藥物釋放變得緩慢，延長藥物在體內(nèi)循環(huán)時間，紅外光照射下，體系釋藥有加快的趨勢，但敏感性降低．圖7(c)是Lips/C6@AuNCs-GSH體系藥物釋放曲線，GSH存在下，光照下體系36 h總釋放率達(dá)到94.23%，略高于Lips/C6@AuNCs．GSH屬于腫瘤因子，在腫瘤微環(huán)境中，濃度較高，可見Lips/C6@AuNCs進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，可以自主結(jié)合GSH，增加光促釋藥靈敏性，快速釋藥．FA是典型的腫瘤靶向因子，在Lips/C6@AuNCs表面修飾上FA，可以增強(qiáng)體系腫瘤靶向效應(yīng)，從圖7(d)看出，該體系在紅外光照射下，藥物釋放增強(qiáng)非常明顯，36 h可以達(dá)到89.68%的釋放率．

紅線：近紅外光照組，黑線：無光照組圖7 Lips/C6@AuNCs體系及各修飾體系的光熱釋藥曲線

AuNCs的光熱轉(zhuǎn)換能力使得脂質(zhì)體雙膜破裂，藥物快速地釋放，病變部位藥物濃度急劇升高，可達(dá)到較好的治療效果．另外，Lips/C6@AuNCs-KGM體系有對于脂質(zhì)體膜表面的對抗血流剪切應(yīng)力的保護(hù)作用，延長藥物停留時間，減少藥物運(yùn)輸中的泄露，將藥物盡可能多地運(yùn)輸?shù)讲∽儾课唬委熜Ч眩甃ips/C6@AuNCs-FA體系具有靶向腫瘤的功能，藥物主動運(yùn)輸至腫瘤部位，減少對健康細(xì)胞的損害，提高藥物生物利用度，增強(qiáng)抗癌效果．

3.7 體外細(xì)胞毒性及光熱治療

以BSA為模板合成的AuNCs合成條件溫和，生物相容好，具有較好的光熱效應(yīng)；C6具有一定的毒性可作為模擬藥物，通過標(biāo)準(zhǔn)的噻唑蘭(MTT)法檢測不同濃度AuNCs、C6、Lips/C6@AuNCs體系處理48 h的HepG2細(xì)胞的細(xì)胞活性．0～200 nmol/mL濃度的AuNCs幾乎不對HepG2細(xì)胞產(chǎn)生毒性，如圖8(a)，證實(shí)了AuNCs應(yīng)用于載藥體系的良好的生物相容性；而香豆素6的細(xì)胞毒性很明顯，200 nmol/mL濃度下HepG2細(xì)胞的存活率僅50%，200 nmol/mL也作為合適的濃度用于接下來的體外光熱治療實(shí)驗(yàn)．

AuNCs與Lips/C6@AuNCs均具有良好的光熱效應(yīng)，可應(yīng)用于光熱治療．將808 nm激光作為光源，分別對濃度為200 nmol/mL的AuNCs、Lips/C6與Lips/C6@AuNCs激光照射(2.0 W/cm2，5 min)．下圖8(b)結(jié)果顯示，AuNCs具有一定的光熱治療效果，而Lips/C6沒有光熱效應(yīng)則無光熱治療效果，Lips/C6@AuNCs聯(lián)合光熱與化學(xué)治療，對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒性達(dá)70%以上，治療效果顯著．

圖8 (a)AuNCs、C6的HepG2細(xì)胞毒性；(b)AuNCs、Lips/C6、Lips/C6@AuNCs光熱細(xì)胞毒性

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)中，金納米簇雜化脂質(zhì)體體系Lips/C6@AuNCs藥物封裝率較高，穩(wěn)定性好，光熱效應(yīng)效果明顯，體系具有明顯光促釋藥的特性，近紅外光輻照下能夠?qū)崿F(xiàn)短時間內(nèi)高效定點(diǎn)釋藥；且表面可進(jìn)一步修飾腫瘤靶向因子等，實(shí)現(xiàn)靶向給藥、延長藥物循環(huán)時間等功能．體外光熱與化學(xué)治療腫瘤細(xì)胞效果顯著，本研究為脂質(zhì)體給藥、腫瘤治療等方面提供了新思路．