酵母產(chǎn)還原型谷胱甘肽制備過(guò)程中的穩(wěn)定性研究

鄧張雙 黃 蓉 劉秀繼 李知洪 姚 鵑 李 嘯 杜維力 鄒 坤 龔大春

(1. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院， 武漢 430030； 2. 三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院 中國(guó)輕工業(yè)功能酵母重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖北 宜昌 443002； 3. 安琪酵母股份有限公司研發(fā)中心， 湖北 宜昌 443003)

還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸經(jīng)肽鍵縮合而成的三肽化合物，具有解毒[1]、抗氧化[2]、參與三羧酸循環(huán)及糖代謝[3]等多種生物活性，在藥物、調(diào)味食品和化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，市場(chǎng)前景巨大．目前，還原型谷胱甘肽主要通過(guò)酵母發(fā)酵[4]、酶法合成[5]和化學(xué)合成[6]等方法制得，其中酵母發(fā)酵制備生產(chǎn)是常用工業(yè)化方法．因還原型谷胱甘肽含有的巰基異?；顫?，制備過(guò)程中容易發(fā)生氧化反應(yīng)形成二巰鍵生成分子間偶聯(lián)產(chǎn)物氧化型谷胱甘肽(GSSG)，從而導(dǎo)致生物活性丟失．因此，如何克服還原型谷胱甘肽氧化，是個(gè)熱點(diǎn)研究方向．目前關(guān)于還原型谷胱甘肽氧化過(guò)程和機(jī)制的研究工作更多是基于高純度標(biāo)準(zhǔn)品開(kāi)展[7]，實(shí)際生產(chǎn)制備受工藝條件、環(huán)境因子等因素影響，可參考價(jià)值有限．本文基于酵母發(fā)酵制備還原型谷胱甘肽工藝，針對(duì)生產(chǎn)線上酵母源富還原型谷胱甘肽溶液開(kāi)展溫度、pH、溶氧和外源抗氧化試劑對(duì)還原型谷胱甘肽穩(wěn)定性的影響，初步闡明還原型谷胱甘肽降解機(jī)制，為酵母制備還原型谷胱甘肽工藝優(yōu)化提供參考．

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酵母源富GSH溶液由安琪酵母股份有限公司研發(fā)中心提供，溶液pH值為2，GSH質(zhì)量濃度為2～3 mg/mL．

GSH和GSSG標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；亞硫酸鈉、抗壞血酸、抗壞血酸鈉、植酸鈉、連二亞硫酸鈉、庚烷磺酸鈉、磷酸二氫鉀購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二硫蘇糖醇購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其余試劑均為分析純．

1.2 儀器與設(shè)備

LC3000Ⅰ型高效液相色譜儀、Waters XevoTQD三重四極桿液相質(zhì)譜聯(lián)用儀、AVANTI離心機(jī)(J-26XP)、HH-S24s數(shù)顯恒溫水浴鍋、Auto Science抽濾機(jī)AP-01P、KQ2200型超聲波清洗儀、METTLER TOLEDO電子天平、METTLER TOLEDO pH計(jì)及其他玻璃儀器．

1.3 方法

1.3.1 還原型谷胱甘肽HPLC檢測(cè)方法[8]

流動(dòng)相配制：庚烷磺酸鈉2.2 g、磷酸二氫鉀6.8 g加1 L純化水溶解后調(diào)節(jié)pH 3.0，加入110 mL甲醇，膜過(guò)濾超聲后待用．

檢測(cè)條件：波長(zhǎng)210 nm、柱溫35℃、Venusil XBP C18色譜柱.

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別準(zhǔn)確稱取GSH和GSSG標(biāo)準(zhǔn)品40 mg，用少量純化水溶解后定容至10 mL，配制成4 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液．然后取5 mL標(biāo)準(zhǔn)液，用純化水定容至10 mL，得到2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液．重復(fù)上述步驟分別得到1、0.5、0.25、0.05、0.01 mg/mL的GSH和GSSG標(biāo)準(zhǔn)液供HPLC分析．

GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：

y=8 823 800.677x+135 940.387 2(R2=0.999 3)

GSSG標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：

y=12 970 305.63x+655 488.719 9(R2=0.999 1)

其中：x為樣品質(zhì)量濃度(mg/mL)；y為峰面積．

在0.01～4 mg/mL的范圍內(nèi)樣品質(zhì)量濃度與峰面積成線性關(guān)系，且線性關(guān)系良好．

1.3.3 溫度對(duì)GSH穩(wěn)定性的影響

用錐形瓶取100 mL酵母源富GSH溶液，分別放置在4℃、25℃、50℃、75℃、100℃的水浴中，每隔2 h取樣檢測(cè)，計(jì)算GSH和GSSG的質(zhì)量濃度變化．所有實(shí)驗(yàn)平行3次，取平均值．

1.3.4 pH對(duì)GSH穩(wěn)定性的影響

用錐形瓶取100 mL酵母源富GSH溶液，分別調(diào)節(jié)溶液pH值為2、3、4、5、6、7、8、9，室溫(25℃)敞口放置，每隔24 h取樣檢測(cè)，計(jì)算GSH和GSSG的質(zhì)量濃度變化．所有實(shí)驗(yàn)平行3次，取平均值．

1.3.5 溶氧對(duì)GSH穩(wěn)定性的影響

用錐形瓶取100 mL酵母源富GSH溶液，在室溫(25℃)和自然pH的條件下，用空氣泵通入空氣，每隔1 h取樣檢測(cè)，計(jì)算GSH和GSSG的質(zhì)量濃度變化．其中自然放置的樣品設(shè)為對(duì)照．所有實(shí)驗(yàn)平行3次，取平均值．

1.3.6 抗氧化劑的添加對(duì)GSH穩(wěn)定性的影響

用錐形瓶取100 mL酵母源富GSH溶液8批次，分別加入過(guò)量(1 g)的抗氧化劑，分別調(diào)節(jié)溶液pH值至2～9，室溫(25℃)敞口放置，每隔24h取樣檢測(cè)，計(jì)算GSH和GSSG的質(zhì)量濃度變化．其中不添加抗氧化劑的樣品設(shè)為對(duì)照．所有實(shí)驗(yàn)平行3次，取平均值．

1.3.7 抗氧化劑的添加量對(duì)GSH穩(wěn)定性的影響

用錐形瓶取100 mL酵母源富GSH溶液10批次，分別按照溶液中GSSG質(zhì)量濃度的0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5和5.0倍劑量添加抗氧化劑，調(diào)節(jié)pH值，室溫(25℃)敞口放置，每隔24 h取樣檢測(cè)，計(jì)算GSH和GSSG的質(zhì)量濃度變化．取未添加抗氧劑的溶液為對(duì)照組．所有實(shí)驗(yàn)平行3次，取平均值．

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度對(duì)GSH穩(wěn)定性的影響

如圖1所示，隨著溫度的升高，溶液中GSH質(zhì)量濃度逐漸下降，且溫度越高，氧化程度越大．在4℃條件下，24 h后GSH氧化程度為27.5%；而在100℃條件下，24 h后GSH氧化程度達(dá)到89.8%．同時(shí)實(shí)驗(yàn)表明，在12 h內(nèi)，4℃和25℃條件下，溶液中GSH質(zhì)量濃度差異性不大．因此，本文后續(xù)實(shí)驗(yàn)采取室溫操作．

圖1 溫度對(duì)GSH穩(wěn)定性的影響

2.2 pH對(duì)GSH穩(wěn)定性的影響

由圖2可知，在pH 2～9范圍內(nèi)，隨著溶液pH值的增加，溶液中GSH質(zhì)量濃度逐漸下降，且pH值越高，氧化程度越大．在pH 6～9范圍內(nèi)，8 d內(nèi)GSH基本全部氧化，氧化程度達(dá)到98.9%～99.4%；在pH 3～5范圍內(nèi)，8 d內(nèi)GSH氧化程度達(dá)到82.1%～92.9%；在pH為2條件下，氧化速度減緩，8 d內(nèi)氧化了約51.9%．因此，溶液pH值越低越利于GSH的保存；短期內(nèi)(1～2 d)保藏富GSH的溶液，宜調(diào)節(jié)溶液pH值為2．

圖2 pH對(duì)GSH穩(wěn)定性的影響

2.3 溶氧對(duì)GSH穩(wěn)定性的影響

如圖3所示，往富GSH的溶液中通入空氣的時(shí)間越長(zhǎng)，溶液中GSH質(zhì)量濃度下降越快，在4 h后，溶液中GSH幾乎全部氧化，氧化程度達(dá)94.2%．而作為對(duì)照組(不通空氣)，僅有少量GSH氧化．因此，富GSH的溶液宜采用真空保存或采用惰性氣體保護(hù)．

圖3 溶氧對(duì)GSH穩(wěn)定性的影響

2.4 抗氧化劑的添加量對(duì)GSH穩(wěn)定性的影響

篩選了植酸鈉、抗壞血酸、抗壞血酸鈉、連二亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、二硫蘇糖醇(DTT)6種常見(jiàn)的抗氧化試劑用于溶液中GSH氧化反應(yīng)阻斷實(shí)驗(yàn)．如圖4所示，添加植酸鈉后的3 d實(shí)驗(yàn)中，溶液中GSH呈現(xiàn)高pH導(dǎo)致的氧化反應(yīng)，未起到抑制氧化發(fā)生的效果．而且，添加抗壞血酸、抗壞血酸鈉、連二亞硫酸鈉3種試劑后的效果與此一致．

圖4 添加植酸鈉對(duì)GSH穩(wěn)定性的影響

如圖5所示，在富GSH溶液中添加亞硫酸鈉后，在pH 2～6范圍內(nèi)，短期內(nèi)(1～3 d)有明顯抑制GSH氧化的效果，但未能完全阻斷氧化反應(yīng)發(fā)生，這可能與亞硫酸鈉的過(guò)量添加有關(guān)；在堿性條件下，反而加速氧化．結(jié)合溶液中GSSG質(zhì)量濃度分析，亞硫酸鈉最優(yōu)添加pH值為5.0．

圖5 添加亞硫酸鈉對(duì)GSH穩(wěn)定性的影響

如圖6所示，在富GSH溶液中添加二硫蘇糖醇(DTT)后，在pH 2～7范圍內(nèi)(特別是pH 6的條件下)，能完全阻斷氧化反應(yīng)發(fā)生，并由GSSG逆向反應(yīng)生產(chǎn)GSH，提升溶液中GSH的質(zhì)量濃度，且3 d內(nèi)GSH質(zhì)量濃度穩(wěn)定；但在堿性條件下，DTT并不能抑制氧化反應(yīng)發(fā)生，最優(yōu)添加pH值為6.0．

圖6 添加二硫蘇糖醇對(duì)GSH穩(wěn)定性的影響

DTT是一種常見(jiàn)的還原劑，常用于巰基化DNA的還原和去保護(hù)，其還原由兩步連續(xù)的巰基-二巰鍵交換反應(yīng)完成，最終生成DTT的環(huán)狀氧化結(jié)構(gòu)．

2.5 抗氧化劑的添加量對(duì)GSH穩(wěn)定性的影響

按照溶液中GSSG質(zhì)量濃度的0.5～5.0當(dāng)量比例添加亞硫酸鈉，結(jié)果見(jiàn)表1．相比對(duì)照，按照時(shí)間縱向比較，適當(dāng)添加亞硫酸可以抑制還原型GSH發(fā)生氧化反應(yīng)，維持GSH質(zhì)量濃度在試驗(yàn)天數(shù)(5 d)內(nèi)基本穩(wěn)定；過(guò)量添加亞硫酸可致GSH發(fā)生降解反應(yīng)，GSH質(zhì)量濃度降低．且最佳添加倍數(shù)為溶液中GSSG質(zhì)量濃度的1.5～4.0倍．按照時(shí)間橫向比較，放置1 d，最佳添加量為0.5倍；放置2 d，最佳添加量為1.0；放置3 d，最佳添加量為2.0倍；放置4 d或5 d，最佳添加量為3.5倍．依此，可維持GSH在響應(yīng)時(shí)間內(nèi)質(zhì)量濃度不發(fā)生變化．

表1 添加不同比例的亞硫酸鈉對(duì)溶液中GSH質(zhì)量濃度(mg/mL)的影響

按照溶液中GSSG質(zhì)量濃度的0.5～5.0當(dāng)量比例添加DTT，結(jié)果見(jiàn)表2．相比對(duì)照，添加DTT后24 h內(nèi)能有效提升GSH溶液中GSH的質(zhì)量濃度，且隨著添加倍數(shù)的增加，GSH質(zhì)量濃度逐漸增加，主要是DTT能使溶液中GSSG逆反應(yīng)生成GSH所致．但是隨著時(shí)間延長(zhǎng)，參與反應(yīng)的DTT消耗殆盡，則GSH的質(zhì)量濃度重新呈現(xiàn)下降趨勢(shì)．因此，短時(shí)間(1～2 d)內(nèi)保藏GSH，應(yīng)按照溶液中GSSG質(zhì)量濃度的1.0～5.0倍添加DTT較為合適．具體添加策略為：放置1 d，最佳添加量為>1.0倍；放置2 d，最佳添加量為>1.5倍；放置3 d，最佳添加量為>3.5倍．

表2 添加不同比例的DTT對(duì)溶液中GSH質(zhì)量濃度(mg/mL)的影響

2.6 GSH氧化降解產(chǎn)物及雜質(zhì)鑒定

采用LC-MS對(duì)酵母源富GSH溶液進(jìn)行雜質(zhì)鑒定，根據(jù)分子量推測(cè)鑒定4個(gè)雜質(zhì)，分別為GSH[O]、L-谷氨酸-L-半胱氨酸-α-丙氨酸、GSSG和PGA．GSH在溶液中極不穩(wěn)定，本文推測(cè)GSH質(zhì)變機(jī)理如圖7所示，GSH通過(guò)酰胺鍵斷裂，氨基酸縮合、聚合和氧化等反應(yīng)生成系列質(zhì)變化合物．首先GSH通過(guò)酰胺鍵斷裂降解為H-半胱氨酸-甘氨酸-OH(Cys-Gly)和谷氨酸(Glu)以及OH-半胱氨酸-谷氨酸-H(Cys-Glu)和甘氨酸(Gly)；H-半胱氨酸-甘氨酸-OH發(fā)生氧化生成(CG)2，谷氨酸發(fā)生縮聚反應(yīng)生成聚谷氨酸(PGA)；H-半胱氨酸-甘氨酸-OH進(jìn)一步斷裂酰胺鍵生成半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)；半胱氨酸巰基發(fā)生氧化形成Cy2，甘氨酸與半胱氨酸縮合生成H-甘氨酸-半胱氨酸-OH(Gly-Cys)；H-半胱氨酸-甘氨酸-OH(Cys-Gly)與GSH縮合形成GSH-CG．另外值得注意是，巰基在氧化劑(氧氣)存在的情況下，可發(fā)生反應(yīng)生成亞砜[9]，是否深度氧化生成砜和磺酸，需要深入試驗(yàn)驗(yàn)證．

專利文獻(xiàn)報(bào)道[10]，歐洲藥典9.0(European Pharmacopoeia 9.0)中對(duì)GSH的雜質(zhì)檢查項(xiàng)下，規(guī)定了4個(gè)已知雜質(zhì)和1個(gè)未知雜質(zhì)，已知雜質(zhì)為Cys-Gly、Cys、Cys-Glu和GSSG，未知雜質(zhì)可能為L(zhǎng)-谷氨酸-L-半胱氨酸-α-丙氨酸，產(chǎn)生來(lái)源可能是微生物在生產(chǎn)GSH時(shí)，末端甘氨酸被α-丙氨酸取代，非GSH質(zhì)變產(chǎn)生．本文從分子量上檢測(cè)并推測(cè)該雜質(zhì)的存在，且保留時(shí)間與GSH接近，后續(xù)需要從發(fā)酵工藝和化合物結(jié)構(gòu)鑒定等方面作進(jìn)一步確證．

圖7 GSH溶液質(zhì)變機(jī)理推測(cè)

3 結(jié) 論

還原型谷胱甘肽(GSH)結(jié)構(gòu)中位于半胱氨酸上的巰基與其抗氧化、解毒等重要生理活性直接相關(guān)．在工業(yè)生產(chǎn)中和自然保存的條件下，巰基易發(fā)生二巰鍵形成的氧化反應(yīng)，生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)．

溫度、pH、溶氧是化學(xué)物質(zhì)生產(chǎn)和保存中普遍面臨的致變因子．本文研究表明：溶氧對(duì)GSH氧化影響最大，4 h左右，溶液中GSH幾乎全部氧化，氧化程度達(dá)94.2%；溫度影響次之，100℃條件下，24 h后GSH氧化程度達(dá)到89.8%；在pH 6～9的條件下，8 d內(nèi)GSH基本全部氧化，氧化程度達(dá)到98.9%～99.4%．因此，低pH值(pH 2.0)、低溫(4℃)和無(wú)氧條件有利于GSH的穩(wěn)定．

添加外源抗氧化試劑是阻斷氧化反應(yīng)發(fā)生的常規(guī)技術(shù)手段．本文篩選了植酸鈉、抗壞血酸、抗壞血酸鈉、連二亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、二硫蘇糖醇(DTT)6種抗氧化試劑，結(jié)果可以歸納為3種：①一類抗氧化劑為植酸鈉、抗壞血酸、抗壞血酸鈉和連二亞硫酸鈉，既不能逆還原GSSG，也不能抑制GSH氧化降解；②一類抗氧化劑為亞硫酸鈉，低劑量添加下能減緩GSH氧化速度，在最佳添加劑量下(溶液中GSSG質(zhì)量濃度的3.5或者4.0倍，pH值為5.0)，能一段時(shí)間內(nèi)維持GSH質(zhì)量濃度穩(wěn)定．但是過(guò)量添加則導(dǎo)致GSH迅速氧化，GSH質(zhì)量濃度下降；③一類抗氧化劑為二硫蘇糖醇，通過(guò)逆還原GSSG來(lái)阻斷GSH氧化．

在GSH質(zhì)變過(guò)程中，主要質(zhì)變產(chǎn)物還是GSH氧化所致，即GSSG的形成．加強(qiáng)環(huán)境因子控制，特別是pH、溶氧、溫度，可有效減緩GSH的氧化．