RANKL基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死發(fā)病的相關(guān)性

范 雪 趙冬雪

1.遼寧省健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)本鋼總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧本溪 117000；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧沈陽 110000

動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死是嚴(yán)重危害人類健康的全球性疾病，然而目前各類人群的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)仍然無法準(zhǔn)確預(yù)測[1]。動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死表現(xiàn)出很強(qiáng)的遺傳易感性，不同基因型人群對該病的易感性不同。我們通過篩查該病的易感基因，可對易感人群進(jìn)行早期預(yù)警。核因子κB 受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL） 基因rs9533156 位點(diǎn)多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的關(guān)系在國內(nèi)人群中尚未開展過研究，本研究旨在探討RANKL 基因rs9533156 位點(diǎn)多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死發(fā)病的相關(guān)性。RANKL 是腫瘤壞死因子 （tumor necrosis factor，TNF）超家族重要的成員之一。RANKL 基因?qū)儆冖蛐涂缒さ鞍?，人RANKL 基因位于染色體13q14，是破骨細(xì)胞分化和活化的重要細(xì)胞因子，表達(dá)于成骨細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞表面[2]。RANKL 能刺激趨化因子釋放、單核巨噬細(xì)胞基質(zhì)遷移和基質(zhì)金屬蛋白酶活性，在動(dòng)脈粥樣硬化中起著重要作用[3]。Biscetti 等[4]研究發(fā)現(xiàn)在意大利人群中RANKL 基因rs9533156 多態(tài)性顯著（55.0%比36.5%，P＜0.0001），與缺血性腦卒中的發(fā)病獨(dú)立相關(guān)，RANKL 的遺傳變異是缺血性腦卒中獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。由此推斷RANKL 基因rs9533156 多態(tài)性與中國遼寧漢族人群腦梗死的易感性也可能相關(guān)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年3月～2018年7月就診于中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科診斷為動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的213 例患者作為病例組，男142 例，女71例，年齡45～70 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合第四屆全國腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)及改良TOAST 分型標(biāo)準(zhǔn)[5]（因發(fā)病機(jī)制的不同，選擇發(fā)病率最高的大動(dòng)脈粥樣硬化型進(jìn)行研究）；②影像學(xué)檢查[頭磁共振成像（MRI）+磁共振血管造影(MRA)、頸部血管彩超]支持以上診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴腦出血的腦梗死者；②小動(dòng)脈閉塞型腦梗死者；③心源性腦栓塞者；④血管畸形或動(dòng)脈炎所致的腦梗死者；⑤有嚴(yán)重心、肝、腎功能不全者；⑥腫瘤、自身免疫性疾病者。選取同期同醫(yī)院體檢中心的健康體檢者197 例作為對照組，男112 例，女85例，年齡45～70歲，排除標(biāo)準(zhǔn)同病例組。入選對象均為遼寧漢族人，彼此間無親緣關(guān)系，簽署知情同意書后進(jìn)行血樣采集，均符合盛京醫(yī)院倫理委員會(huì)制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

所有入選者空腹抽取靜脈血2 ml 加入EDTA-2K 抗凝管中，使用天根血液DNA 提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司）按說明書的步驟提取，提取出的DNA 采用PCR 技術(shù)進(jìn)行目的基因片段的擴(kuò)增，再應(yīng)用改良多重連接酶反應(yīng)技術(shù)對rs9533156 位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。PCR 及連接引物由上海天昊生物有限公司設(shè)計(jì)（表1）。連接產(chǎn)物上ABI3730XL 測序儀（北京龍躍生物科技發(fā)展有限公司），測序儀上收集的原始數(shù)據(jù)采用GeneMapper 4.1（Applied Biosystems，USA）軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡分析，明確樣本是否具有群體代表性。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Logistic 回歸分析研究基因型與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的相關(guān)性，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基因型分布及等位基因頻率

病例組和對照組的SNP 位點(diǎn)均滿足Hardy-Weinberg 平衡（χ2=1.371，P=0.242），說明該樣本具有良好的群體代表性。RANKL 基因rs9533156 位點(diǎn)的三種基因型為TT、CT、CC。以TT 為參照，CT 和CC 基因型在病例組和對照組中的Logistic 分析結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。以等位基因T 為參照，等位基因C 在病例組和對照組中的Logistic 分析結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見表2）。

2.2 兩組顯性模型和隱性模型RANKL-rs9533156 基因型的比較

顯性模型和隱性模型分析顯示，兩組RANKLrs9533156 基因型比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表3）。

表1 RANKL-rs9533156 PCR 引物及連接引物

表2 兩組RANKL-rs9533156 基因型分布及等位基因頻率的比較[n（%）]

表3 兩組顯性模型和隱性模型RANKL-rs9533156 基因型的比較

3 討論

多種類型的細(xì)胞都可表達(dá)RANKL，例如破骨細(xì)胞、活化的T/B 細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、乳腺上皮細(xì)胞等[6]。研究表明[7]，RANKL 對骨重建、乳腺發(fā)育、T/B 細(xì)胞的早期分化、淋巴結(jié)形成、體溫調(diào)節(jié)等重要生理過程發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，同時(shí)還參與了乳腺癌的發(fā)生、腫瘤骨轉(zhuǎn)移、骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)炎等病理過程。Sassi 等[8]研究發(fā)現(xiàn)在絕經(jīng)后的突尼斯婦女中，RANKL 基因-643C/T的多態(tài)性與骨質(zhì)疏松的風(fēng)險(xiǎn)具有相關(guān)性。Yang 等[9]研究發(fā)現(xiàn)RANKL 基因rs2277438 多態(tài)性增加了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。Petean 等[10]研究發(fā)現(xiàn)RANKL基因rs9594738 多態(tài)性與持續(xù)性根尖周炎發(fā)病顯著相關(guān)。Shaker 等[11]研究發(fā)現(xiàn)RANKL 基因多態(tài)性與乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后密切相關(guān)。Mrozikiewicz-Rakowska 等[12]研究發(fā)現(xiàn)RANKL 基因rs9533156 多態(tài)性與糖尿病足的發(fā)病相關(guān)。SaiPrathiba 等[13]研究發(fā)現(xiàn)RANKL 基因-643C/T 與2 型糖尿病合并神經(jīng)病變單獨(dú)顯著相關(guān)。Wang 等[14]研究發(fā)現(xiàn)RANKL 基因單倍型rs7984870C/rs9533155G/rs9525641C 與強(qiáng)直性脊柱炎敏感性呈負(fù)相關(guān)。Biscetti 等[4]已經(jīng)證實(shí)在意大利人群中RANKL 基因rs9533156 多態(tài)性與缺血性腦卒中發(fā)病顯著相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示：在中國遼寧漢族人群中RANKL 基因rs9533156 多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)病無相關(guān)性。得出的結(jié)論不同首先可能是因?yàn)榛蚨鄳B(tài)性與疾病的關(guān)系在不同種族中存在著差異。意大利人群屬于歐洲白種人，遼寧漢族人群屬于亞洲黃種人，基因多態(tài)性本身存在種族和地域的差異性，研究得出的結(jié)論可以不同。例如路甲鵬等[15]研究發(fā)現(xiàn)，歐洲西部和北部后裔、中國北京漢族人、日本東京人，尼日利亞的約巴魯人4 個(gè)種群中，鹽敏感性高血壓易感基因多態(tài)性的分布有著顯著差異。其次本研究為單中心病例對照研究，樣本量相對較小，結(jié)果可能出現(xiàn)偏倚。應(yīng)繼續(xù)收集樣本，多中心跨地域收集，以便做進(jìn)一步的研究，反復(fù)驗(yàn)證結(jié)論的準(zhǔn)確性。