沙利度胺治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的效果及對(duì)患者Th17和Treg細(xì)胞分化平衡的影響

吳曉亮 蘇偉雄

1.廣東省東莞市大朗醫(yī)院血液風(fēng)濕免疫科，廣東東莞 523770；2.廣東省東莞市大朗醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東東莞 523770

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是最常見(jiàn)的自身免疫和全身性炎癥引起的疾病之一，以滑膜關(guān)節(jié)的炎癥和畸形為特征，常見(jiàn)癥狀包括疲勞、低熱、晨僵、頭痛、食欲不振和體重減輕等，病情嚴(yán)重者可導(dǎo)致骨和軟骨的糜爛。在我國(guó)，RA 患病率為0.20%～0.36%[1]。沙利度胺是一種可溶性的腫瘤壞死因子（TNF-α）受體融合蛋白，能與人源的TNF-α 發(fā)生高親和度的、競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合，使TNF-α 喪失其生物活性，弱化其參與炎癥反應(yīng)的作用，從而對(duì)免疫性疾病達(dá)到治療目的。雖然沙利度胺對(duì)RA 的治療能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)患者病情控制的目的，但其治療RA 的分子生物學(xué)機(jī)制仍未明確。為探討沙利度胺對(duì)RA 的治療機(jī)制，尋找RA 的更有效治療方法，需要考慮到免疫介導(dǎo)的慢性炎癥的分子和病理基礎(chǔ)。一般而言，Th17 細(xì)胞能夠促進(jìn)自身免疫，而Treg 細(xì)胞可以防止發(fā)生自身免疫性疾病[2]，輔助T 細(xì)胞（Th17）與調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）之間的平衡也被證明在自身免疫中具有極其重要的意義。本研究通過(guò)觀察沙利度胺對(duì)RA 患者的治療效果，并開(kāi)展對(duì)RA 患者用藥前后Th17、Treg 等細(xì)胞群的研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年6月～2019年10月我院收治的80例RA 患者作為研究對(duì)象，其中男26 例，女54 例；年齡37～63 歲，平均（44.16±3.51）歲；疾病持續(xù)時(shí)間3.5～12.5年，平均（5.77±0.82）年。按照隨機(jī)數(shù)字表法將入選患者分為治療組與對(duì)照組，各40 例。治療組中，男13 例，女27 例；年齡38～64 歲，平均（44.21±3.63）歲；病程3.6～12.2年，平均（5.81±0.74）年。對(duì)照組中，男15 例，女25 例；年齡37～64 歲，平均（44.67±3.14）歲；病程3.5～12.4年，平均（5.65±0.77）年。同時(shí)選取在我院體檢的40 名健康人群作為健康組，其中男14 例，女26 例；年齡37～65 歲，平均（44.58±3.47）歲。三組的性別、年齡等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。兩組的病程比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。所有入選者均知情同意本研究并簽署知情同意書(shū)。本研究符合《赫爾辛基宣言》要求，且得到了東莞市大朗醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審查批準(zhǔn)。RA 患者診斷標(biāo)準(zhǔn)： 參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)風(fēng)濕病學(xué)分會(huì)制定的《2018年中國(guó)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療指南》制訂[3-5]。RA 患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合診斷標(biāo)準(zhǔn)；③所有患者均知情同意本研究并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重心、肺、肝、腎系統(tǒng)疾病者；②合并惡性腫瘤患者；③合并精神系統(tǒng)疾病無(wú)法配合本研究者；④不愿意參與本研究者。

1.2 治療方法

對(duì)照組患者給予常規(guī)治療，如常規(guī)健康教育、關(guān)節(jié)功能鍛煉、藥物治療（非甾體類抗炎藥、傳統(tǒng)抗風(fēng)濕藥物）等。治療組在對(duì)照組的基礎(chǔ)上加用沙利度胺（常州制藥廠有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H32026128，批號(hào)：20150722）口服，50 mg/次，1 次/d。兩組均治療12 周。

1.3 檢測(cè)方法

所有RA 患者治療前、 治療結(jié)束后均采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17、Treg 細(xì)胞亞群，健康組在體檢時(shí)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17、Treg 細(xì)胞亞群，具體方法如下。

采用Ficoll 梯度離心法獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），采用磁活化細(xì)胞分選純化CD4+T 細(xì)胞，采用0.1 g/ml 的PMA和1 g/ml 的離子霉素刺激8 h，1 μl/ml 加入布雷非德菌素A 撫育4 h。采用藻紅蛋白偶聯(lián)的IL-17A 單抗和異藻藍(lán)蛋白（APC）偶聯(lián)的γ-干擾素單抗（eBioscience）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。CD4 淋巴細(xì)胞在染色前進(jìn)行分離，Treg 細(xì)胞的分離使用了人緣Treg 細(xì)胞分離試劑盒（Human Treg Flow Kit，BioLegend Ozyme），試驗(yàn)操作按照制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，細(xì)胞亞群分類如下。①Th17 細(xì)胞：CD4+IL-17+； ②Treg 細(xì)胞：CD4+CD25+（高水平表達(dá)）FoxP3+。流式細(xì)胞儀采用本實(shí)驗(yàn)室的LSRⅡflow cytometer （BD Biosciences）進(jìn)行操作，并用FlowJo 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4 觀察指標(biāo)及評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

比較兩組患者治療后的臨床效果，觀察兩組患者治療前后及健康組的Th17、Treg 細(xì)胞比例，其中療效判定標(biāo)準(zhǔn)如下。①顯效：患者能夠獨(dú)立行走，活動(dòng)不受限，關(guān)節(jié)腫脹、積液消失，無(wú)發(fā)熱，關(guān)節(jié)晨僵時(shí)間顯著縮短，睡眠時(shí)無(wú)明顯疼痛；②有效：患者行走仍受限，但關(guān)節(jié)腫脹、積液減少，無(wú)發(fā)熱，關(guān)節(jié)晨僵時(shí)間縮短，睡眠時(shí)偶有疼痛；③無(wú)效：患者行走仍然困難，關(guān)節(jié)腫脹，睡眠時(shí)疼痛，晨僵時(shí)間無(wú)明顯改變，仍發(fā)熱，實(shí)驗(yàn)室化驗(yàn)各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)明顯改善[6-7]。總有效=顯效+有效。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)、方差分析；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療組與對(duì)照組患者臨床治療效果的比較

治療組的總有效率為95.00%，高于對(duì)照組的75.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 治療組與對(duì)照組患者臨床治療效果的比較[n（%）]

2.2 健康組、治療組、對(duì)照組Th17、Treg 細(xì)胞比例及Th17 與Treg 細(xì)胞比值的比較

治療組及對(duì)照組治療前的Th17 細(xì)胞比例、Th17/Treg 細(xì)胞比值高于健康組，Treg 細(xì)胞亞群比例低于健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。治療組及對(duì)照組治療后的Th17 細(xì)胞比例、Th17/Treg 細(xì)胞比值高于健康組，Treg 細(xì)胞亞群比例低于健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。治療組與對(duì)照組患者治療前的Th17、Treg 細(xì)胞比例及Th17/Treg 值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療組與對(duì)照組患者治療后的Th17 細(xì)胞比例、Th17/Treg 細(xì)胞比值低于治療前，Treg 細(xì)胞亞群比例高于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。治療組治療后的Th17 細(xì)胞比例、Th17/Treg 細(xì)胞比值低于對(duì)照組，Treg 細(xì)胞亞群比例高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

3 討論

目前，關(guān)于RA 發(fā)病機(jī)制的研究還不太透徹，大量研究認(rèn)為，RA 的發(fā)病與人體自身免疫系統(tǒng)引發(fā)的炎癥有關(guān)[8-10]。原始的T 細(xì)胞在體內(nèi)不同細(xì)胞因子微環(huán)境的作用下可以分化成Th1、Th2、Th17、Follicular T、Treg 等細(xì)胞群。在自身免疫性疾病中，Th17 與Treg細(xì)胞亞群的比值對(duì)機(jī)體免疫耐受和免疫系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡有非常重要的指示作用[11]，也被證明在RA 的發(fā)病及進(jìn)展中起到了重要的作用[12-13]。

表2 健康組、治療組、對(duì)照組Th17、Treg 細(xì)胞比例及Th17 與Treg細(xì)胞比值的比較（±s）

表2 健康組、治療組、對(duì)照組Th17、Treg 細(xì)胞比例及Th17 與Treg細(xì)胞比值的比較（±s）

組別 Th17 Treg Th17/Treg健康組（n=40）治療組（n=40）治療前治療后t 值P 值對(duì)照組（n=40）治療前治療后t 值P 值0.38±0.072.04±0.32 0.19±0.03 2.14±0.39 1.28±0.13 12.0381＜0.05 0.31±0.07 1.53±0.18 12.1266＜0.05 5.90±1.18 0.84±0.22 27.3128＜0.05 t 健康組與治療組治療前比較值P 健康組與治療組治療前比較值t 健康組與對(duì)照組治療前比較值P 健康組與對(duì)照組治療前比較值t 治療組與對(duì)照組治療前比較值P 治療組與對(duì)照組治療前比較值t 治療組與對(duì)照組治療后比較值P 治療組與對(duì)照組治療后比較值t 健康組與治療組治療后比較值P 健康組與治療組治療后比較值t 健康組與對(duì)照組治療后比較值P 健康組與對(duì)照組治療后比較值2.12±0.33 1.72±0.18 5.8039＜0.05 14.8631＜0.05 15.2932＜0.05 0.2511＞0.05 12.0184＜0.05 8.9010＜0.05 13.3105＜0.05 0.33±0.09 1.04±0.08 14.3571＜0.05 23.0386＜0.05 21.3545＜0.05 0.1442＞0.05 6.4025＜0.05 8.4172＜0.05 11.0561＜0.05 5.42±1.31 1.71±0.29 21.3423＜0.05 41.5624＜0.05 38.0711＜0.05 1.0522＞0.05 14.0534＜0.05 7.4834＜0.05 13.8759＜0.05

沙利度胺是一種合成類谷氨酸衍生物，在免疫性疾病、皮膚病及多種惡性腫瘤的臨床治療中有著特殊的效果，具有抗新生血管、抗TNF-α、調(diào)節(jié)多種IL 和黏附因子的表達(dá)、誘導(dǎo)凋亡、抗增殖、免疫調(diào)節(jié)、抗肺纖維化等藥理作用，可以用于抗炎及免疫調(diào)節(jié)[14-15]。研究顯示，采用沙利度胺聯(lián)合甲氨蝶呤、沙利度胺聯(lián)合來(lái)氟米特和甲氨蝶呤治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者具有顯著的效果[16-17]。

本研究結(jié)果顯示，RA 患者治療前與健康人群相比，Th17 細(xì)胞亞群增加，而Treg 細(xì)胞比例有所降低。通過(guò)比較RA 患者治療前與健康人群Th17/Treg 細(xì)胞亞群的比值，證實(shí)了RA 患者Th17 細(xì)胞與Treg 細(xì)胞之間的失衡（Th17/Treg 比值增大），與之前的文獻(xiàn)報(bào)道類似[18-19]。兩組患者治療后的Th17 細(xì)胞比例、Th17/Treg 細(xì)胞比值低于治療前，Treg 細(xì)胞亞群比例高于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。治療組治療后的Th17 細(xì)胞比例、Th17/Treg 細(xì)胞比值低于對(duì)照組，Treg 細(xì)胞亞群比例高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示沙利度胺能夠調(diào)節(jié)Th17 與Treg 細(xì)胞的平衡。

綜上所述，沙利度胺能夠調(diào)節(jié)Th17 與Treg 細(xì)胞的平衡，這是對(duì)Treg 與Th17 細(xì)胞亞群平衡機(jī)制的重要補(bǔ)充，能夠?yàn)镽A 和其他自身免疫性疾病的治療提供一條潛在的新途徑。