基于拉曼鑷子的發(fā)酵過程單細(xì)胞分析：應(yīng)用與展望*

王桂文，黃庶識(shí)，陶站華

(廣西科學(xué)院，廣西南寧 530007)

0 引言

已有研究顯示，看似均一的微生物群體，其細(xì)胞間卻在遺傳、生理、生化或者個(gè)體行為上存在很大的差異[1]，這種遺傳上或表觀上的異質(zhì)性是微生物細(xì)胞能夠適應(yīng)并生存于逆境，或持久生存并給人帶來疾病的基礎(chǔ)[2，3]。該異質(zhì)性對(duì)諸如抗生素或者殺菌劑抗性的研究、工業(yè)發(fā)酵的生產(chǎn)力和穩(wěn)定性、食物防腐的有效性，以及病原微生物的致病潛力等都有非常重要的影響[4-8]。傳統(tǒng)上對(duì)微生物的認(rèn)識(shí)多數(shù)是通過研究其群體樣品而得到的統(tǒng)計(jì)平均信息，但對(duì)微生物的深入研究、認(rèn)識(shí)微生物細(xì)胞與環(huán)境的相互作用，僅靠傳統(tǒng)的群體分析難以獲得突破性進(jìn)展，而技術(shù)的進(jìn)步為探測(cè)分析單個(gè)細(xì)胞甚至單分子提供了可能[9]。單細(xì)胞分析技術(shù)的發(fā)展在認(rèn)識(shí)細(xì)胞的異質(zhì)性、拓展細(xì)胞生物學(xué)研究深度等方面發(fā)揮了重要的作用[10]，更有不少報(bào)道綜述有關(guān)單細(xì)胞分析在微生物領(lǐng)域的應(yīng)用及其分析方法[3，10-14]?；诖耍疚暮?jiǎn)單回顧基于單細(xì)胞的代謝過程分析方法，并重點(diǎn)回顧拉曼鑷子在微生物發(fā)酵領(lǐng)域的一些應(yīng)用進(jìn)展，分析其在應(yīng)用中所存在的問題，認(rèn)為拉曼鑷子在克服自身不足、融合新的分析技術(shù)與數(shù)據(jù)處理方法后，將是了解細(xì)胞異質(zhì)性、認(rèn)知復(fù)雜生物過程的有力手段。

1 基于單細(xì)胞的代謝過程分析

單細(xì)胞代謝分析可以提供細(xì)胞群體內(nèi)單個(gè)細(xì)胞代謝異質(zhì)性的信息。分析過程包含兩方面：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞的分離與單個(gè)細(xì)胞的分析。目前的分析技術(shù)雖然已經(jīng)可以從單個(gè)細(xì)胞中測(cè)量出數(shù)百種代謝物，但樣品的制備仍然是單細(xì)胞代謝分析中的一個(gè)難題[15]。

細(xì)胞的分離(即樣品的制備)是進(jìn)行單細(xì)胞分析的前提，其目的是實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞的獨(dú)立，便于后續(xù)分析。傳統(tǒng)的分離方法是梯度稀釋，新發(fā)展的技術(shù)方法主要有：(1)流式技術(shù)以及在此基礎(chǔ)上衍生的各種方法，包括流式細(xì)胞儀、微流控[16，17]與液滴微流控[18]等；(2)能夠可逆和非動(dòng)態(tài)地定位單個(gè)或多個(gè)單細(xì)胞的永久固定方法，包括3D微腔，0維、1維和2維禁錮等；(3)單個(gè)或多個(gè)單細(xì)胞被固定并根據(jù)需要釋放的動(dòng)態(tài)定位方法，通常使用的是外部刺激法，包括機(jī)械微操作、光學(xué)微操作(光鑷)、散射力(輻射壓力)、光電鑷子、電泳微操作等[11]。

根據(jù)基本屬性，單細(xì)胞的分析技術(shù)有兩大類：一類是能夠?qū)?xì)胞實(shí)行動(dòng)態(tài)、無損分析的技術(shù)，包括無須標(biāo)記的微光譜化學(xué)分析(如拉曼光譜、共振拉曼、表面增強(qiáng)拉曼、相干拉曼和紅外顯微光譜等分子振動(dòng)光譜方法，以及X射線等)、電化學(xué)分析以及熒光介導(dǎo)的微分析(如需要熒光染色的流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡、熒光壽命成像、熒光相關(guān)光譜等)；另一類是非動(dòng)態(tài)的、破壞性的分析技術(shù)，即質(zhì)譜和核磁共振等[11]，具體的方法和應(yīng)用參見Ishii等[12]、Rubakhin等[15]、Fritzsch等[19]、Zenobi[20]和Hodzic[21]的綜述。不斷出現(xiàn)的新技術(shù)和新方法，大大地促進(jìn)了單細(xì)胞分析的發(fā)展，提高了人們對(duì)生物細(xì)胞異質(zhì)性的認(rèn)識(shí)。然而，很多技術(shù)方法的樣品制備過程比較復(fù)雜，且需要較長(zhǎng)的分析時(shí)間，限制了其發(fā)展應(yīng)用。因此，可以快速提供細(xì)胞信息、實(shí)時(shí)顯示微生物細(xì)胞即時(shí)生理反應(yīng)且又簡(jiǎn)便靈敏的分析方法，是未來重點(diǎn)發(fā)展的方向。其中，拉曼鑷子技術(shù)因具有非接觸、無須標(biāo)記、無損等優(yōu)點(diǎn)，且具有對(duì)單個(gè)細(xì)胞實(shí)施分離和動(dòng)態(tài)分析的能力，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

2 拉曼鑷子在微生物發(fā)酵中的應(yīng)用

拉曼光譜是一種分子振動(dòng)光譜，其效應(yīng)來源于光的非彈性散射，直接反映物質(zhì)分子振動(dòng)/旋轉(zhuǎn)振動(dòng)狀態(tài)[22，23]，在應(yīng)用于生物材料研究時(shí)具有以下獨(dú)特優(yōu)勢(shì)：一是水分子的拉曼效應(yīng)很弱，基本上不影響生物細(xì)胞的拉曼分析；二是樣品無須特別處理，對(duì)樣品沒有破壞性；三是實(shí)時(shí)、快速；四是樣品需要量極少，可以在單細(xì)胞甚至亞細(xì)胞水平檢測(cè)，因此其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[24-28]。在微生物發(fā)酵領(lǐng)域，拉曼光譜主要應(yīng)用在發(fā)酵進(jìn)程的總體監(jiān)控方面[29-36]，在單細(xì)胞水平開展的研究較少。單個(gè)細(xì)胞的拉曼光譜包含核酸、蛋白質(zhì)、多糖和脂類等細(xì)胞物質(zhì)的固有特性信息，是細(xì)胞基因型、表型和生理狀態(tài)的表現(xiàn)[37-40]。單細(xì)胞拉曼光譜為細(xì)胞分析提供了一種便利的、無損的定位手段，可以在亞微米尺度(單細(xì)胞水平)探測(cè)細(xì)胞的生理狀態(tài)[24]，分析化學(xué)因子對(duì)細(xì)胞的影響[41，42]。

拉曼鑷子(Raman tweezers，也稱Laser tweezers Raman Spectroscopy)是激光鑷子與顯微拉曼的結(jié)合，融合了無接觸光學(xué)操控和拉曼分析的優(yōu)勢(shì)，可在接近自然的生理狀態(tài)下研究單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞器，或判別不同類型、不同狀態(tài)的細(xì)胞[37,43-45]。與一般的顯微拉曼相比，拉曼鑷子有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)光鑷可以將單個(gè)活細(xì)胞固定在焦點(diǎn)附近進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)測(cè)(圖1)；(2)細(xì)胞處于光束焦點(diǎn)位置，優(yōu)化了散射光的收集光路，獲得更高的信噪比(圖1插圖A)，得到的是被俘獲細(xì)胞生化組分光譜信息的疊加；(3)常規(guī)的共焦拉曼光譜采集前需要預(yù)處理微生物細(xì)胞，費(fèi)時(shí)費(fèi)力且對(duì)細(xì)胞的生理狀態(tài)帶來未知的影響，而拉曼鑷子直接將樣品細(xì)胞懸浮在無菌水或者生理溶液中，省時(shí)省力且能保持細(xì)胞正常的生理狀態(tài)。

插圖A為處于光阱或者黏附在蓋玻片的Cupriavidus necator單個(gè)細(xì)胞的拉曼光譜對(duì)比Inset A：Single-cell Raman spectra of Cupriavidus necator cells while trapped or adhered onto cover圖1 拉曼鑷子的基本構(gòu)成[46，47]Fig.1 Basic composition of Raman tweezers[46,47]

Chan[37]、Redding等[43]和Snook等[48]較為詳細(xì)地回顧了拉曼鑷子的應(yīng)用，但比較寬泛。因此，本部分結(jié)合筆者小組在微生物發(fā)酵領(lǐng)域所做的一些探索，重點(diǎn)回顧拉曼鑷子在微生物發(fā)酵領(lǐng)域的一些應(yīng)用。

2.1 發(fā)酵過程單個(gè)細(xì)胞的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)

實(shí)時(shí)無損無標(biāo)記生理分析是拉曼鑷子的優(yōu)勢(shì)之一，因而其可以長(zhǎng)時(shí)間對(duì)同一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，獲知微生物細(xì)胞實(shí)時(shí)的生理變化。拉曼鑷子主要監(jiān)測(cè)有特殊產(chǎn)物的細(xì)胞或者是有明顯指紋峰的物質(zhì)，甚至定量分析單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)特定物質(zhì)的生理過程，比如乙醇發(fā)酵[39]或者物理(化學(xué))脅迫下細(xì)胞的動(dòng)態(tài)生化變化[49]。Peng等[39]通過實(shí)時(shí)分析單個(gè)酵母細(xì)胞的發(fā)酵過程，發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞啟動(dòng)好氧發(fā)酵3 min內(nèi)就能產(chǎn)生乙醇，而且在高濃度底物下，發(fā)酵起始階段胞內(nèi)的乙醇濃度高于胞外(胞內(nèi)外實(shí)時(shí)乙醇濃度比為1.5左右，圖2)，胞內(nèi)累積的乙醇隨著胞外底物濃度的降低而釋放。Singh等[49]實(shí)時(shí)觀察單個(gè)酵母細(xì)胞在熱處理和高滲透溶液下的應(yīng)激反應(yīng)，觀測(cè)到遲滯期的酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入含10%葡萄糖的培養(yǎng)液后33 min開始生成甘油和乙醇，在39 min生成速率達(dá)到峰值，單個(gè)細(xì)胞生成約300 amol的甘油和700 amol乙醇。

圖2 10%(W/V)葡萄糖底物發(fā)酵時(shí)單個(gè)酵母細(xì)胞內(nèi)外乙醇濃度變化的拉曼鑷子監(jiān)測(cè)[39]Fig.2 Raman tweezers monitoring of intracellular and extracellular concentrations of ethanol in individual yeast cells during fermentation in YM media after supplementation of 10% (W/V) glucose[39]

當(dāng)拉曼鑷子系統(tǒng)中使用雙光鑷或者多光鑷俘獲細(xì)胞時(shí)，可以在相同的生理?xiàng)l件下記錄多個(gè)微生物單細(xì)胞的實(shí)時(shí)光譜，了解細(xì)胞間的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)和異質(zhì)性[50]。由于拉曼光譜的信號(hào)比較弱，要獲得較強(qiáng)的拉曼信號(hào)，需要較強(qiáng)的激光激發(fā)，因此實(shí)時(shí)分析主要應(yīng)用在較短時(shí)間內(nèi)的監(jiān)測(cè)。

2.2 發(fā)酵過程大量單個(gè)細(xì)胞的分析

要較好地反映完整的群體發(fā)酵過程，需要分析大量的單個(gè)細(xì)胞，但是拉曼鑷子難以對(duì)多個(gè)單細(xì)胞實(shí)施長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。因此，不同的學(xué)者應(yīng)用拉曼鑷子針對(duì)不同的發(fā)酵(培養(yǎng))階段隨機(jī)選擇一批細(xì)胞進(jìn)行分析，從拉曼光譜的角度展示發(fā)酵過程單個(gè)細(xì)胞胞內(nèi)物質(zhì)的變化動(dòng)態(tài)，既可以獲知發(fā)酵的總體進(jìn)程，又可以獲知發(fā)酵過程不同階段或同一階段細(xì)胞間的差異，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，該技術(shù)比常規(guī)的分子生物學(xué)手段更加簡(jiǎn)便快捷。其中涉及的主要光譜分析手段一是直接讀取蛋白質(zhì)、脂類、核酸或者目標(biāo)產(chǎn)物的特征峰信號(hào)強(qiáng)度，二是把細(xì)胞光譜信息作為一個(gè)數(shù)據(jù)整體，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)，判別細(xì)胞所處的生理狀態(tài)，通過影響因子來分析引起差異的原因。

2.2.1 特殊產(chǎn)物發(fā)酵

微生物細(xì)胞通常會(huì)在胞內(nèi)累積聚酯、色素等物質(zhì)，由于這類物質(zhì)通常有比較特殊的拉曼特征峰，是拉曼鑷子研究的便利對(duì)象。

2.2.1.1 聚酯

聚β-羥基丁酸(PHB)是一種生物塑料[51-53]。已有針對(duì)PHB合成的研究主要是基于群體細(xì)胞水平在宏觀層面上探索，比如優(yōu)化發(fā)酵環(huán)境[54，55]，應(yīng)用顯微拉曼進(jìn)行定量檢測(cè)[56]以及分析其含量的異質(zhì)性[57]。筆者所在的小組[58-61]應(yīng)用拉曼鑷子分析C.necatorH16菌株P(guān)HB累積過程，并跟蹤胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)的代謝動(dòng)態(tài)。Tao等[59]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示遲滯期與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期是胞內(nèi)生物大分子代謝的活躍時(shí)期，而PHB在發(fā)酵后不久即開始產(chǎn)生，在對(duì)數(shù)初期開始大量累積，表明該菌株啟動(dòng)PHB合成的因素并非營養(yǎng)因子的匱乏(圖3)。

圖3 C.necator H16菌株的生長(zhǎng)曲線及胞內(nèi)RNA (782 cm-1)、DNA (1 574 cm-1)、蛋白質(zhì)(1 650 cm-1)、PHB (1 732 cm-1)等物質(zhì)的特征峰強(qiáng)度隨發(fā)酵進(jìn)程的變化動(dòng)態(tài)Fig.3 Growth curve of C.necator H16 strain and characteristic peak intensity change of intracellular RNA(782 cm-1 ),DNA(1 574 cm-1),protein (1 650 cm-1),and PHB (1 732 cm-1) with the fermentation process

單個(gè)細(xì)胞主要生物大分子特征拉曼峰分析顯示，RNA是PHB合成過程代謝中最為活躍的生物大分子。在較高碳濃度下，細(xì)胞核酸物質(zhì)長(zhǎng)時(shí)間維持在較高的水平；即使僅提供有限的碳源，H16細(xì)胞還是將部分碳源用于合成PHB ，而不是將所有的碳源完全用于細(xì)胞生長(zhǎng)[58]。在不同的氮源下，PHB快速合成期也是胞內(nèi)生物大分子的活躍期，氮源主要影響RNA和蛋白質(zhì)的代謝進(jìn)而影響PHB產(chǎn)物的合成[60]。

不同碳氮比條件下的PHB發(fā)酵分析顯示，在高氮環(huán)境下細(xì)胞的RNA含量(782 cm-1峰)和蛋白質(zhì)含量(1 656 cm-1峰)一直處于較高的水平，兩者呈線性正相關(guān)關(guān)系。但蛋白質(zhì)含量(1 656 cm-1峰)與PHB含量(1 732 cm-1峰)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，胞內(nèi)活躍且含量高的RNA 有可能加強(qiáng)蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而削弱PHB 的合成。在高碳氮比環(huán)境下，核酸以及蛋白質(zhì)的合成受阻，導(dǎo)致碳源的代謝途徑從三羧酸循環(huán)轉(zhuǎn)向PHB合成路徑[61]。

2.2.1.2 類胡蘿卜素

微生物可以產(chǎn)生各種色素。其中生物來源的類胡蘿卜素是一類重要的天然色素，比化學(xué)合成的類胡蘿卜素具有更低的毒性和更高的生物利用度。類胡蘿卜素是異戊二烯類化合物，具有多個(gè)共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，在1 157，1 524 cm-1附近各有一個(gè)典型的、強(qiáng)烈的特征峰。Tao等[40]采用拉曼鑷子對(duì)圓紅冬孢酵母的類胡蘿卜素進(jìn)行實(shí)時(shí)定量監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，類胡蘿卜素和脂質(zhì)的積累主要發(fā)生在指數(shù)期的后期和靜止階段，即當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)受到營養(yǎng)限制時(shí)；同時(shí)，類胡蘿卜素濃度隨核酸濃度的變化而變化，在培養(yǎng)的第一階段增加，在培養(yǎng)的最后階段減少。袁玉峰等[62]利用拉曼鑷子對(duì)紅酵母合成類胡蘿卜素進(jìn)行分析，考查氮源和碳源對(duì)類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)適宜紅酵母細(xì)胞生長(zhǎng)和類胡蘿卜素合成的氮源和碳源分別是酵母粉+胰蛋白胨、葡萄糖。王雪等[63,64]用拉曼鑷子分析紅法夫酵母內(nèi)蝦青素含量，優(yōu)化了紅法夫酵母生產(chǎn)蝦青素的條件。孫美娟等[65]應(yīng)用拉曼鑷子對(duì)圓紅冬孢酵母合成油脂和類胡蘿卜素進(jìn)行定量分析，考察不同碳氮比、碳磷比以及碳硫比對(duì)圓紅冬孢酵母油脂和類胡蘿卜合成能力的影響，結(jié)果表明隨著碳氮比、碳磷比和碳硫比的升高，圓紅冬孢酵母細(xì)胞內(nèi)油脂含量均逐步增加，而類胡蘿卜素的含量均顯著降低。

2.2.1.3 脂肪酸

脂類物質(zhì)也是學(xué)者們研究的重點(diǎn)對(duì)象，微藻因能夠合成和儲(chǔ)存可以轉(zhuǎn)化為生物柴油的脂類(如脂肪酸和三酰甘油TAG)而重新引起學(xué)者的重大關(guān)注。Wu等[66]應(yīng)用拉曼鑷子對(duì)產(chǎn)油微藻的脂質(zhì)譜進(jìn)行直接的、無須標(biāo)記的在體定量分析，測(cè)定微藻內(nèi)組成脂質(zhì)的不飽和度和轉(zhuǎn)變溫度，為微藻的脂質(zhì)濃度提供相對(duì)快速的監(jiān)測(cè)。Wang等[67]采用類似的技術(shù)在單細(xì)胞水平定量表征了微藻產(chǎn)油過程，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)群體層面細(xì)胞油脂分析方法難以揭示的規(guī)律，即單個(gè)細(xì)胞水平的TAG含量與脂類不飽和度呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。單細(xì)胞TAG定量技術(shù)直接跳過細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)節(jié)，因此能夠分析未培養(yǎng)的微生物。

2.2.1.4 葡萄球菌黃素

陶站華等[68]分析單個(gè)金黃色葡萄球菌細(xì)胞內(nèi)葡萄球菌黃素相對(duì)含量，并考察吲哚濃度及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)色素含量的影響。其群體和單細(xì)胞水平的光譜數(shù)據(jù)均表明，吲哚可劑量依賴性地抑制葡萄球菌黃素的合成；在分批培養(yǎng)中，群體中大多數(shù)細(xì)胞的色素含量在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期同步達(dá)到最大值，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的群體內(nèi)部細(xì)胞間色素含量的異質(zhì)性較小。用1 523 cm-1特征峰強(qiáng)度表征胞內(nèi)葡萄球菌黃素的相對(duì)含量，顯示在22—37℃時(shí)，溫度對(duì)葡萄球菌黃素合成的影響不大；中性pH最有利于葡萄球菌黃素的合成；在一定濃度范圍內(nèi)(0.2—5.0 g/L)，葡萄糖可劑量依賴性地促進(jìn)葡萄球菌黃素的合成，黃酮?jiǎng)t可劑量依賴性地抑制葡萄球菌黃素的合成[69]。

上述研究顯示，拉曼鑷子能夠在單細(xì)胞水平可靠地分析微生物細(xì)胞特殊產(chǎn)物的含量，既可以監(jiān)測(cè)有特殊拉曼峰的產(chǎn)物發(fā)酵動(dòng)態(tài)，又可以同時(shí)獲知發(fā)酵過程胞內(nèi)主要生物大分子的變化動(dòng)態(tài)。

2.2.2 重組蛋白發(fā)酵

重組蛋白質(zhì)發(fā)酵是將攜帶重組質(zhì)粒的工程菌培養(yǎng)至一定密度，經(jīng)誘導(dǎo)后獲得目的蛋白的一種手段。該技術(shù)過量表達(dá)目的基因，從而獲得大量廉價(jià)的目的蛋白，因而單個(gè)細(xì)胞的拉曼信號(hào)可能會(huì)有明顯的不同，可通過拉曼光譜方法監(jiān)測(cè)其發(fā)酵進(jìn)程，從而省去蛋白提取、電泳等繁雜的環(huán)節(jié)，為分析細(xì)胞的發(fā)酵過程開辟新的可能性。Xie等[70]最先在大腸桿菌和畢赤酵母兩種不同的表達(dá)系統(tǒng)中監(jiān)測(cè)斑馬魚β生長(zhǎng)抑素的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)單個(gè)大腸桿菌或者畢赤酵母相關(guān)蛋白峰的信號(hào)強(qiáng)度隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而增強(qiáng)，與凝膠電泳和蛋白印跡分析結(jié)果相符。Chan等[71]監(jiān)測(cè)髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)表達(dá)主要發(fā)生在第2小時(shí)內(nèi)，相對(duì)于第1小時(shí)表達(dá)的蛋白質(zhì)增加470%，而第3小時(shí)相對(duì)第2小時(shí)增加230%，表明3 h內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)開始平穩(wěn)。

盧明倩等[72]研究甲酸脫氫酶(FDH)重組蛋白在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)水平，F(xiàn)DH的特征峰1 004，1 355，1 455和1 667 cm-1隨著IPTG誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，峰信號(hào)強(qiáng)度的增加值所反映的FDH表達(dá)量增多與SDS-PAGE電泳分析結(jié)果一致。

周冰等[73]分析大腸桿菌所表達(dá)的蠶豆ViciafabaL. 14-3-3b可溶性蛋白與包涵體蛋白的結(jié)構(gòu)差異，以及不同溫度下兩種蛋白在重組菌中的表達(dá)水平，結(jié)果表明：16℃下誘導(dǎo)的14-3-3b可溶性蛋白特征峰強(qiáng)度明顯強(qiáng)于28℃下誘導(dǎo)的，而包涵體蛋白的特征峰強(qiáng)度則相反。黃庶識(shí)等[74]實(shí)時(shí)分析不同溫度下上述兩種蛋白的動(dòng)態(tài)表達(dá)水平時(shí)發(fā)現(xiàn)：28℃培養(yǎng)條件下，重組菌蛋白質(zhì)過量表達(dá)并以形成包涵體為主；16℃條件下以可溶性蛋白為主，且在該溫度下表達(dá)的蛋白質(zhì)能正確折疊，有利于細(xì)胞形成穩(wěn)定的可溶性蛋白。

上述文獻(xiàn)表明，拉曼鑷子對(duì)單個(gè)活細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)等生物過程的實(shí)時(shí)、無損和定量監(jiān)測(cè)具有足夠的敏感性。

2.2.3 生物乙醇發(fā)酵

通過追蹤單個(gè)酵母細(xì)胞特征拉曼峰信號(hào)強(qiáng)度的變化，可有效地分析葡萄糖、乙醇等物質(zhì)的變化，以及胞內(nèi)核酸、脂類及蛋白質(zhì)等生物大分子含量及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。

2.2.3.1 不同發(fā)酵過程下的動(dòng)態(tài)分析

彭立新等[75]監(jiān)測(cè)活性干酵母活化與生長(zhǎng)過程：釀酒活性干酵母復(fù)水活化后，核酸類物質(zhì)迅速增加，RNA在第6小時(shí)達(dá)到最大值；蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)從第6小時(shí)開始快速增加，在第9小時(shí)達(dá)到最大值，而后呈下降趨勢(shì)；胞內(nèi)乙醇則是在第9小時(shí)開始出現(xiàn)，在第9—12小時(shí)期間大量生成。

李自達(dá)等[76]分析500 L發(fā)酵罐木薯淀粉濃醪乙醇發(fā)酵過程中酵母細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的變化，結(jié)果顯示酵母細(xì)胞為適應(yīng)濃醪發(fā)酵環(huán)境會(huì)調(diào)整細(xì)胞的生理狀態(tài)和胞內(nèi)組分：隨著乙醇濃度的升高，酵母細(xì)胞累積蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)逐漸以無規(guī)則卷曲為主；在發(fā)酵后期，部分酵母細(xì)胞在胞內(nèi)累積大量的嘌呤類物質(zhì)。

pH值是影響酵母乙醇發(fā)酵的重要因子。覃趙軍等[77]從拉曼光譜學(xué)角度對(duì)不同初始pH值的乙醇發(fā)酵過程進(jìn)行分析，結(jié)果顯示發(fā)酵后期，在pH值為3.0的條件下，胞內(nèi)脂類和蛋白質(zhì)的拉曼信號(hào)最強(qiáng)，表明在低pH值環(huán)境下部分底物被轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)儲(chǔ)藏物質(zhì)；主成分分析顯示，pH值對(duì)酵母細(xì)胞生理狀態(tài)的影響始于發(fā)酵初始階段；1 440和1 600 cm-1峰一直是影響主成分PC1、PC2和PC3分值的主要特征峰，說明pH條件可能影響酵母細(xì)胞的脂類物質(zhì)合成和呼吸代謝，進(jìn)而影響底物的代謝方向和產(chǎn)物的合成。

覃趙軍等[78]分析不同氮源對(duì)酵母乙醇發(fā)酵的影響及其可能的分子機(jī)制。在有機(jī)氮源下，酵母細(xì)胞進(jìn)入新的發(fā)酵環(huán)境后立即快速合成RNA，并且含量顯著高于無機(jī)氮源下的，其RNA拉曼峰的最大平均強(qiáng)度是初始平均強(qiáng)度的1.9—2.1倍(無機(jī)氮源的為1.2—1.4倍)；無機(jī)氮源下脂類物質(zhì)和DNA的含量高于有機(jī)氮源。有機(jī)氮源縮短酵母的遲滯期，促進(jìn)胞內(nèi)RNA快速大量合成，促進(jìn)與氮源代謝、乙醇發(fā)酵相關(guān)基因的快速轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)乙醇發(fā)酵。

覃趙軍等[79]分析高滲環(huán)境對(duì)酵母乙醇發(fā)酵代謝的影響。高滲透壓會(huì)顯著影響782，1 301，1 602，1 657 cm-1峰所表征物質(zhì)的合成時(shí)間和強(qiáng)度，進(jìn)而影響代謝方向，而耐高滲菌株能適應(yīng)高滲環(huán)境，調(diào)整胞內(nèi)組分含量，實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)發(fā)酵。不同滲透壓下影響第一主成分的主要特征峰是1 302—1 306 cm-1和1 443 cm-1等源自脂類物質(zhì)的拉曼峰，說明滲透壓影響胞內(nèi)脂類物質(zhì)的合成。

在逆境發(fā)酵中，不管是普通菌株還是耐乙醇的菌株，RNA物質(zhì)往往在發(fā)酵前期就開始大量合成，而蛋白質(zhì)、脂類物質(zhì)則是在乙醇大量合成的時(shí)候才開始大量合成；蛋白質(zhì)、脂類物質(zhì)峰的升高與環(huán)境中乙醇濃度有關(guān)，與菌株關(guān)聯(lián)性不大，可能是酵母菌株應(yīng)對(duì)逆境的手段(結(jié)果待發(fā)表)。

2.2.3.2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化

拉曼鑷子除可以監(jiān)測(cè)胞內(nèi)物質(zhì)的總量變化外，還可以監(jiān)測(cè)發(fā)酵過程酵母細(xì)胞蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。

賴鈞灼等[80]在監(jiān)測(cè)以葡萄糖為底物的乙醇發(fā)酵動(dòng)態(tài)過程中發(fā)現(xiàn)：在發(fā)酵前期，細(xì)胞1 662 cm-1峰(表征蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ的無規(guī)則卷曲)與1 652 cm-1峰(表征蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ的α螺旋)的強(qiáng)度之比(I1662/I1652)小于1，7 h后大于1，9—18 h基本維持在同一水平，而后呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，說明發(fā)酵初期胞內(nèi)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以有序的α螺旋為主，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酵母細(xì)胞蛋白質(zhì)以無規(guī)則卷曲為主。在李自達(dá)等[76]研究的高濃度底物酵母發(fā)酵后期，也出現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。而在以酵母粉為氮源的不同發(fā)酵階段，部分細(xì)胞的蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ的二級(jí)結(jié)構(gòu)以β折疊為主，也有部分細(xì)胞以α螺旋為主，還有一部分細(xì)胞則是兩者基本均衡，而以其他物質(zhì)為氮源的細(xì)胞則是以α螺旋占絕對(duì)主導(dǎo)地位[78]。出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因有可能是在較高濃度的乙醇環(huán)境下，酵母細(xì)胞為適應(yīng)胞內(nèi)外乙醇環(huán)境的變化而改變蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

2.2.4 發(fā)酵過程中細(xì)胞的異質(zhì)性

針對(duì)大量單個(gè)細(xì)胞的分析可以獲知群體細(xì)胞的生理狀態(tài)以及細(xì)胞間的差異。

在濃醪乙醇發(fā)酵中，胞內(nèi)蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)(特征峰1 301，1 440，1 654 cm-1)在發(fā)酵前、中期的細(xì)胞間差異較小，而發(fā)酵后期(32，44 h)這兩類物質(zhì)的含量顯著增加，胞間差異明顯增大；核酸類物質(zhì)，在發(fā)酵前、中期，782 cm-1與1 094 cm-1的信號(hào)峰強(qiáng)度呈離散分布，但進(jìn)入發(fā)酵后期后，核酸含量增加且在細(xì)胞間的分布接近正態(tài)分布；嘌呤物質(zhì)(特征峰1 480 cm-1)在發(fā)酵的前、中期胞內(nèi)含量很少，胞間差異不大，而在發(fā)酵的后期迅速增加，細(xì)胞間差異大且呈兩極分化，含量較少的細(xì)胞占多數(shù)，含量很高的細(xì)胞占少數(shù)[76]。

在PHB發(fā)酵中，直方統(tǒng)計(jì)分析顯示，發(fā)酵前期細(xì)胞間胞內(nèi)PHB含量差異較大，發(fā)酵中期相對(duì)均勻、胞間差異小，但發(fā)酵后期胞間差異顯著[59]。根據(jù)奇異值分布可知菌體的代謝方向、產(chǎn)物的差別自發(fā)酵開始就不一致，并且隨著發(fā)酵的進(jìn)行差異越來越大[60]。

3 存在的問題

3.1 熒光背景

熒光對(duì)拉曼監(jiān)測(cè)有非常嚴(yán)重的干擾[81]，拉曼鑷子也存在同樣的問題，特別是在溶液或者細(xì)胞有自發(fā)熒光的時(shí)候，拉曼信號(hào)通常湮滅于熒光中。Cormack等[82]發(fā)現(xiàn)使用拉蓋爾-高斯(LG)和Holey高斯激光時(shí)，可以減少拉曼系統(tǒng)中光學(xué)元件的背景熒光。另外，也可以使用長(zhǎng)波長(zhǎng)的激光(比如1 064 nm)來激發(fā)拉曼信號(hào)[83]，或者通過數(shù)據(jù)處理來消除熒光的影響[84]。其他熒光背景消除方法還有表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)、傅立葉變換拉曼光譜技術(shù)，或者加入熒光淬滅劑，但是后者可能會(huì)影響細(xì)胞的活性。

3.2 激光損傷

激光長(zhǎng)時(shí)間俘獲同一個(gè)細(xì)胞可能會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生傷害，特別是在激光功率比較大的時(shí)候。激光光損傷主要包括光化學(xué)損傷(例如氧化、DNA損傷、細(xì)胞代謝)和光熱(熱致)損傷，損傷的程度與使用的波長(zhǎng)、細(xì)胞類型有關(guān)。由于拉曼鑷子的細(xì)胞處于溶液中，因此減小了光熱損傷，對(duì)細(xì)胞的損失主要是光化學(xué)損傷。Singh等[49]使用能量較低的長(zhǎng)波長(zhǎng)近紅外激光(1 064 nm)用于俘獲細(xì)胞，而用短波長(zhǎng)的激光(532 nm或者785 nm)激發(fā)細(xì)胞的拉曼信號(hào)；或者是用同一束激光俘獲與激發(fā)細(xì)胞，在激發(fā)拉曼的時(shí)候用較高功率而在俘獲的時(shí)候用較低功率，以減少激光對(duì)被俘細(xì)胞的傷害。

3.3 分析效率

單個(gè)光鑷的分析效率比較低，特別是長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)測(cè)細(xì)胞的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)時(shí)。為提高分析效率，陸續(xù)發(fā)展了雙光鑷[50]或者多光鑷的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)[85，86]，可以在相同的條件下同步監(jiān)測(cè)多個(gè)細(xì)胞。對(duì)于大量單個(gè)細(xì)胞的非實(shí)時(shí)在線分析，黃超等[87]、毛麗華等[88]將拉曼鑷子與微流控結(jié)合；Casabella等[89]發(fā)展了自動(dòng)分析單個(gè)細(xì)胞的拉曼鑷子系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞光譜信息的自動(dòng)采集；而Pilát等[90]將拉曼鑷子與微流控系統(tǒng)結(jié)合，發(fā)展了自動(dòng)分析和在無菌條件下分選微生物細(xì)胞的方法。除對(duì)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的提升之外，Zhang等[91]在多光鑷?yán)囎拥幕A(chǔ)上發(fā)展了一種基于壓縮傳感的單次采集多焦拉曼光譜技術(shù)，將常規(guī)拉曼光譜的速度提高2—3個(gè)數(shù)量級(jí)，并有望應(yīng)用于監(jiān)測(cè)大尺寸生物系統(tǒng)的快速動(dòng)力學(xué)研究。同時(shí)，Zhang等[92]還發(fā)展了一種壓縮感知框架下的分層稀疏方法，結(jié)合組內(nèi)稀疏性和組內(nèi)選擇策略進(jìn)行光譜重建，有望在長(zhǎng)時(shí)間同步監(jiān)測(cè)多個(gè)細(xì)胞的生物過程中得到廣泛應(yīng)用。

3.4 信號(hào)增強(qiáng)

相對(duì)而言，拉曼鑷子在一定程度上提高了信噪比，獲得了更好的信號(hào)，但信號(hào)弱依然是其需要克服的弱點(diǎn)。為解決該問題，表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)、共振拉曼光譜(RRS)、相干反斯托克斯拉曼光譜(CARS)以及受激拉曼光譜(SRS)相繼發(fā)展，將拉曼信號(hào)增強(qiáng)幾個(gè)數(shù)量級(jí)。Huai等[93]將光鑷與SERS結(jié)合應(yīng)用于蛤蚌毒素的快速檢測(cè)， Ramser等[94-96]將光鑷與共振拉曼結(jié)合應(yīng)用于功能血紅細(xì)胞和血紅蛋白的分析，以及細(xì)菌表達(dá)神經(jīng)珠蛋白，但這些技術(shù)方法很少應(yīng)用到發(fā)酵分析領(lǐng)域。

3.5 數(shù)據(jù)處理與挖掘

拉曼鑷子得到包含核酸、蛋白質(zhì)、多糖和脂類物質(zhì)等反映細(xì)胞固有特性的信息，是所有光譜信息的疊加，如何把關(guān)鍵的信息提取出來是拉曼光譜分析的難點(diǎn)[97]。由于同一個(gè)拉曼譜帶有可能來源于幾個(gè)不同的分子或基團(tuán)，單變量分析嚴(yán)重限制了詳細(xì)信息的獲得。如果把整個(gè)拉曼信息看成數(shù)學(xué)數(shù)據(jù)，則可以應(yīng)用常規(guī)的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法來提取光譜特征信息，從而判別細(xì)胞的生理狀態(tài)。常用的方法有主成分分析(PCA)和奇異值分解，兩者都是一種簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)集的技術(shù)。通過PCA并分析主要PC的載荷與相關(guān)特征峰的相關(guān)性，從中可以獲知不同發(fā)酵階段微生物細(xì)胞胞內(nèi)主要生物大分子的合成特點(diǎn)[58-61,76，77,79]。Iwasaki等[98]通過拉曼顯微鏡可視化分子特異性信息，用多元曲線分辨率分析從拉曼光譜中提取隱藏的關(guān)鍵信息，首次在微藻Euglenagracilis蠟酯發(fā)酵中發(fā)現(xiàn)兩種不同形式的肉豆蔻酸酯的積累。此外，中科院青島過程與能源所提出“拉曼組”(Ramanome)概念(指特定狀態(tài)下一個(gè)細(xì)胞群體的單細(xì)胞拉曼光譜集合)，并以萊茵衣藻、微擬球藻等為模式，基于拉曼組技術(shù)，建立可同時(shí)定量單個(gè)細(xì)胞中淀粉、蛋白質(zhì)、甘油三酯含量和脂質(zhì)不飽和度的方法[99-101]。

3.6 與其他技術(shù)的結(jié)合

從前面的論述可以看出，拉曼鑷子最適宜用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的是目標(biāo)明確的特征拉曼峰，但一般的細(xì)胞光譜是整個(gè)細(xì)胞物質(zhì)的疊加，影響了拉曼鑷子實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的應(yīng)用。Wang等[102]，Xu等[103]將拉曼光譜與穩(wěn)定同位素標(biāo)記(SIP)結(jié)合(同位素的摻入改變了所摻入分子鍵的拉曼帶)，通過氘化代謝底物推導(dǎo)物質(zhì)循環(huán)過程，獲知物質(zhì)代謝動(dòng)態(tài)。Lu等[104]將拉曼鑷子與人工智能技術(shù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)微生物單細(xì)胞水平的快速準(zhǔn)確鑒定。

拉曼鑷子得到的主要信息是底物、產(chǎn)物和核酸、蛋白質(zhì)、脂類等生物大分子的信息，如果與單細(xì)胞測(cè)序、基因表達(dá)分析或者組學(xué)分析相結(jié)合，廣泛涵蓋單個(gè)細(xì)胞中的大多數(shù)成分，則可深入了解細(xì)胞異質(zhì)性的機(jī)制。

此外，目前的研究還沒有完全闡明細(xì)胞異質(zhì)性對(duì)生物性能的影響，但所有研究的最終目標(biāo)是將其應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中，提高發(fā)酵性能。對(duì)拉曼鑷子來說，在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)獲取大量單個(gè)細(xì)胞的信息用于系統(tǒng)生物學(xué)的建模[105]，還需要提高系統(tǒng)的靈敏度和檢測(cè)數(shù)量。

4 展望

微生物發(fā)酵是個(gè)復(fù)雜的過程，是大量單個(gè)細(xì)胞綜合表現(xiàn)的結(jié)果，但細(xì)胞間存在明顯的異質(zhì)性，通過單細(xì)胞分析了解微生物細(xì)胞的異質(zhì)性，有利于發(fā)酵環(huán)境的優(yōu)化，從而減少細(xì)胞間的異質(zhì)性，提高發(fā)酵性能。拉曼鑷子融合了拉曼光譜和光學(xué)操控的優(yōu)點(diǎn)，無破壞、無須標(biāo)記，可以監(jiān)測(cè)單個(gè)細(xì)胞的實(shí)時(shí)生理狀態(tài)，表征微生物細(xì)胞的生理功能，還可以作為一種工具來分析大群體中相對(duì)較小的單細(xì)胞群體(數(shù)千個(gè)細(xì)胞)，以獲得樣本異質(zhì)性的統(tǒng)計(jì)信息，并在單細(xì)胞水平上研究細(xì)胞動(dòng)力學(xué)。本文重點(diǎn)回顧了拉曼鑷子在監(jiān)測(cè)乙醇發(fā)酵、細(xì)胞色素、聚酯及脂肪酸發(fā)酵以及重組蛋白表達(dá)等領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展，顯示拉曼鑷子實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)發(fā)酵過程中物質(zhì)變化的能力以及從單個(gè)細(xì)胞水平上研究發(fā)酵過程的潛能。由于細(xì)胞代謝快速、胞內(nèi)成分多樣，以及拉曼技術(shù)還存在信號(hào)較弱、分析效率不高以及光損傷等問題，拉曼技術(shù)不能完全、迅速和無損地監(jiān)測(cè)發(fā)酵過程多個(gè)單細(xì)胞的代謝物。即便如此，已有的研究仍從分子光譜和單細(xì)胞角度為微生物發(fā)酵提供了新的認(rèn)識(shí)。因此，如能克服自身不足，融合新的分析技術(shù)和數(shù)據(jù)處理手段，拉曼鑷子將在微生物單細(xì)胞分析領(lǐng)域發(fā)揮更大作用。將拉曼分析、微流控分選與組學(xué)分析結(jié)合起來，則可同時(shí)獲知更全面的信息，無疑將推進(jìn)生物單細(xì)胞分析及對(duì)其異質(zhì)性的認(rèn)識(shí)，提高對(duì)復(fù)雜生物系統(tǒng)的認(rèn)知。