TTC法快速測定油桐種子生活力

向振勇，鄭 科，谷麗萍

(1.云南省林業(yè)和草原科學(xué)院/國家林業(yè)和草原局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650204； 2.云南省林業(yè)和草原科學(xué)院林業(yè)研究所，昆明 650204)

油桐(VerniciafordiiHemsl)又名嬰子桐、虎子桐等，是大戟科油桐屬(Vernicia)落葉小喬木、干性木本油料樹種。主要分布于我國南部的15個(gè)省份近200個(gè)縣，越南也有分布，該樹種在我國已有上千年的栽培歷史，通常栽培于海拔1 000 m以下丘陵山地[1,2]。在1983年，我國的桐油產(chǎn)量占世界總量的83%，但到了2009年我國油桐產(chǎn)量僅占世界總產(chǎn)量的35%[3,4]。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，以桐油為基礎(chǔ)原材料生產(chǎn)的涂料具有較好的水性化特點(diǎn)，該涂料有利于更嚴(yán)格的環(huán)保要求并降低了施工過程中的火災(zāi)危險(xiǎn)，其在高檔油漆和特種油漆環(huán)保型產(chǎn)業(yè)方面潛力巨大[4,5]。因此，油桐再次受到關(guān)注。目前，在經(jīng)歷了近20年的產(chǎn)業(yè)低迷后，油桐的種植區(qū)域主要集中在貧困偏遠(yuǎn)的山區(qū)，由于該地區(qū)的天然條件限制，如種植于坡度較大的山坡、石漠化較高的地區(qū)等，油桐的主要繁殖方式采用種子直播繁殖。周元愛研究表明，油桐種子的有效保存方法是露天埋藏，埋藏3年的油桐種子仍能達(dá)到95%以上發(fā)芽率[6]；其種子的含水量是種子萌發(fā)的關(guān)鍵因素, 當(dāng)種子含水量為30%～40%時(shí)，平均萌發(fā)率在81%以上[7]。將油桐種子層積沙藏在含水量40%～50%的濕沙中，于黃土中催芽，28 d后萌發(fā)率達(dá)90%以上[8]。在云南省油桐直播造林的實(shí)際生產(chǎn)中，將當(dāng)年10—11月成熟的油桐種子剝?nèi)ス?，陰干至種皮干燥, 在翌年1—2月份山地直播造林。這種方法最大的缺點(diǎn)在于當(dāng)年旱季的長短和翌年雨季來臨的早晚，有的特殊年份(如2019年)，雨季會(huì)推遲到6月中旬。在6～8個(gè)月的旱季中，油桐種子含水量下降到6%～8%，油桐種子在干燥環(huán)境下會(huì)有少量部分氧化，造成生活力下降，在這種情況下種子是否還具有萌發(fā)能力及其發(fā)芽率的高低均未見報(bào)道。在實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)經(jīng)歷了6～8個(gè)月的長期干旱后，雨季再次來臨，油桐種子的萌發(fā)周期變長(3～4個(gè)月)，甚至不萌發(fā)。這種現(xiàn)象造成了油桐山地直播造林時(shí)整體發(fā)芽率在70%左右，甚至更低，且苗木長勢不一，質(zhì)量較差。由于油桐種子直播造林方式導(dǎo)致的種子生活力下降，萌發(fā)周期長，苗木質(zhì)量差，生產(chǎn)中迫切需要新的方法來快速檢測油桐種子生活力。

TTC染色法在判斷種子生活率和發(fā)芽潛力方面具有快速、有效、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，是國際上常用的有效方法[9-13]。油桐山地直播造林生產(chǎn)中迫切需要解決其跨年度種子的生活率和發(fā)芽率的預(yù)測技術(shù)。本研究采用了單因素試驗(yàn)，正交試驗(yàn)的方法，對(duì)TTC法測定種子活力的3個(gè)主要影響因素進(jìn)行研究，明確了油桐種子生活力檢測的最優(yōu)條件，能夠快速客觀地評(píng)價(jià)油桐種子的萌發(fā)率，為山地造林提供合理的技術(shù)支持。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的油桐種子于2018年11月初采集自云南省文山州官寨鄉(xiāng)油桐種植基地，剝除果皮后于室溫陰涼干燥處保存，其種子平均含水量是6.59%。

1.2 發(fā)芽率測定

將試驗(yàn)的油桐種子放入盆中，加入0.5%的高錳酸鉀溶液消毒40 min，用清水沖洗干凈消毒后的種子，以清洗后的水溶液達(dá)到清亮透明為準(zhǔn)。然后將種子放入800 mg·L-1GA3溶液中常溫陰涼處浸泡48 h。 在直徑15 cm的培養(yǎng)皿中裝入經(jīng)高溫滅菌鍋消過毒的冷涼濕潤沙子，將20粒種子埋入沙子中，每處理重復(fù)3次，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)催芽。待培養(yǎng)2周以后，用尖嘴鑷子輕輕翻動(dòng)濕沙，以油桐胚根露白，且已突破外種皮2 mm以上作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)。從發(fā)芽開始計(jì)算，每隔1周統(tǒng)計(jì)1次發(fā)芽情況，連續(xù)10 d沒有新萌發(fā)的種子視為發(fā)芽結(jié)束。

1.3 試 劑

2,3,5-氯代三苯基四氮唑，pH=7.0磷酸緩沖液，高錳酸鉀。

1.4 種子預(yù)處理方法

1.4.1浸 泡

挑選出外觀飽滿種子，用自來水沖洗干凈，再用純凈水沖洗干凈。將沖洗干凈的種子在室溫下純凈水中浸泡48 h，使得種子充分吸脹。

1.4.2TTC染色試劑的配制

TTC染色試劑的配制參考雷慧霞等[10]的方法，先配制pH=7.0磷酸緩沖液，再在磷酸緩沖液的基礎(chǔ)上配制不同濃度的TTC溶液。本研究采用的TTC溶液濃度分別為0.4%，1%，2%，3%，4%，5%，pH=6.8，200 mL棕色瓶儲(chǔ)存，4 ℃冰箱避光備用。

1.4.3染 色

用枝剪剪開堅(jiān)硬的油桐外種皮，再用手術(shù)刀劃開胚乳，取出發(fā)育良好、完整無損傷的胚，放入pH=7.0的磷酸緩沖液中，待所有胚準(zhǔn)備完畢后，用去離子水沖洗干凈，濾紙吸干胚表面水分。將胚置于培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中放15粒胚，在各培養(yǎng)皿上標(biāo)記出所用的TTC溶液濃度。按照標(biāo)記的濃度加入各個(gè)培養(yǎng)皿，溶液量以沒過胚為宜，將培養(yǎng)皿放置于不同溫度的恒溫箱中, 避光培養(yǎng)。待達(dá)到設(shè)定的培養(yǎng)時(shí)間時(shí)，取出培養(yǎng)皿，去離子水稍稍沖洗胚，然后將胚放置于濾紙上吸去多余水分，以白色濾紙為背景，根據(jù)胚染色深淺和面積大小判斷種子活力。

1.5 胚活力最優(yōu)測定條件試驗(yàn)

1.5.1單因素試驗(yàn)

染色溫度：油桐種子吸脹后，剝出完整無損傷的胚, 每培養(yǎng)皿中放置15粒，TTC濃度為1%，染色3 h，分別在20～45 ℃的范圍區(qū)間內(nèi)，以每間隔5 ℃為1個(gè)染色溫度進(jìn)行染色，測定胚活力。

染色時(shí)間：油桐種子吸脹后，剝出完整無損傷的胚, 每培養(yǎng)皿中放置15粒，TTC濃度為1%，30 ℃下，染色時(shí)間分別為0.5，1，2，3，4，5 h測定胚活力。

TTC濃度：油桐種子吸脹后，剝出完整無損傷的胚, 每培養(yǎng)皿中放置15粒，染色溫度為30 ℃，染色時(shí)間3 h，分別置于0.4%，1%，2%，3%，4%，5%的TTC溶液中染色，測定胚活力。

1.5.2正交試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，采用染色溫度(A)、染色時(shí)間(B)、TTC濃度(C)3個(gè)主要影響油桐種子胚染色的因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。試驗(yàn)的油桐種子胚每組數(shù)量為20粒，無重復(fù)，具體因素設(shè)定見表1。

表1 油桐胚活力測定正交試驗(yàn)因素和水平

1.5.3染色后觀察

對(duì)染色后的胚觀察記錄，按以下標(biāo)準(zhǔn)判斷種子是否有生活力：胚全部或絕大部分染成鮮紅色或大紅色為有生活力種子，只有少部分胚染色或大部分染色為淡粉紅色為低活力或無生活力種子。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office Excel 2016軟件和SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，明確TTC法檢測油桐種子生活力的最佳處理?xiàng)l件。種子生活力和種子發(fā)芽率按以下公式進(jìn)行計(jì)算。

種子生活力(%)=(有生活力的種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

種子發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 油桐種子發(fā)芽率測定結(jié)果

用GA3處理的油桐種子，通常2周以后就會(huì)萌發(fā)，萌發(fā)高峰期在播種后的第21～30天，之后是零星萌發(fā)，整體萌發(fā)時(shí)間長，整個(gè)萌發(fā)期近2個(gè)月。油桐種子3次重復(fù)的發(fā)芽數(shù)分別為17、16、18粒，發(fā)芽率平均值為85%。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由表2可以得出，油桐胚的著色率隨著溫度的升高而升高，在45 ℃時(shí)達(dá)到最高值(71.11%)，但該數(shù)值與40 ℃時(shí)的著色率(68.89%)較為接近，因此認(rèn)為溫度在40 ℃左右時(shí)已經(jīng)可以很好的對(duì)油桐胚進(jìn)行染色；由表3可以得出，油桐胚的著色率隨染色時(shí)間的延長而升高，當(dāng)染色時(shí)間達(dá)到3 h時(shí)，胚著色率的增加幅度較為相近，因此最佳染色時(shí)間在3 h以上；由表4可以得出，油桐胚的著色率隨著TTC濃度的升高而升高，當(dāng)TTC濃度達(dá)到2%以上后，著色率的增加幅度較小，因此油桐胚最佳TTC濃度在2%以上。

表2 油桐胚著色率與染色溫度的關(guān)系

表3 油桐胚著色率與染色時(shí)間的關(guān)系

表4 油桐胚著色率與TTC濃度的關(guān)系

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表5可以得出，油桐胚生活力最高的組合為9，染色溫度40 ℃，染色時(shí)間4 h，TTC濃度2%；胚的生活力最低組合為2和4，分別是：染色溫度30 ℃，染色時(shí)間3 h，TTC濃度3%；染色溫度35 ℃，染色時(shí)間2 h，TTC濃度3%。

表5 油桐胚活力測定正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4 方差分析

對(duì)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析得到表6，試驗(yàn)設(shè)定的3個(gè)因素，染色溫度(A)的p值為0.037，小于0.05，說明染色溫度對(duì)染色結(jié)果起主要作用；染色時(shí)間(B)和TTC濃度(C)的p值分別為0.165和0.062，都大于0.05，該結(jié)果表明這2個(gè)因素在0.05水平上，對(duì)試驗(yàn)染色結(jié)果的作用不顯著。

2.5 極差分析

對(duì)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析(見表5)，可以比較3個(gè)因素各自對(duì)油桐種子胚生活力的影響。3個(gè)因素的極差值分別為：R1=20.95，R2=9.05，R3=4.05，即它們對(duì)油桐種子胚生活力的影響大小依次為：染色溫度>染色時(shí)間>TTC濃度。染色溫度對(duì)油桐種子胚生活力測定影響最大，而TTC濃度影響最小。

表6 方差分析

用各因素所對(duì)應(yīng)極差的最大值來代表最適合測定油桐種子胚的生活力條件，則可以得出染色溫度(因素A)：Ⅰ1、Ⅱ1、Ⅲ1中Ⅲ1值最大，染色溫度選40 ℃；染色時(shí)間(因素B)：Ⅰ2、Ⅱ2、Ⅲ2中Ⅲ2值最大，染色時(shí)間應(yīng)選4 h；TTC濃度(因素C)Ⅰ3、Ⅱ3、Ⅲ3中Ⅰ3值最大，TTC濃度應(yīng)選擇2%。極差分析結(jié)果表明,油桐種子胚TTC染色最佳條件是：染色溫度40 ℃，染色時(shí)間4 h，染色TTC濃度2%。

3 討論與結(jié)論

3.1 TTC法測定油桐種子生活力最佳條件

按照農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程，純凈水配制的TTC染色液pH值在2.5～3.0范圍內(nèi)，油桐種子胚在該pH值下基本無法染色，所以采用pH=7.0磷酸緩沖液配制TTC染色液，使得最終pH為6.8。

由正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的分析結(jié)果得出，染色溫度(A)對(duì)油桐種子胚染色作用顯著，且溫度越高染色效果越好，染色時(shí)間和TTC濃度在正交試驗(yàn)設(shè)定的范圍內(nèi)對(duì)染色結(jié)果不顯著。對(duì)其做極差分析得出：油桐種子胚TTC染色最佳條件是：在40 ℃溫度下，TTC濃度2%時(shí)避光染色4 h。

3.2 TTC法測定油桐種子胚生活力的可行性

本次研究所采用的油桐種子是2018年11月份采收，該批種子剝?nèi)ス麣ず蠓胖糜陉帥龈稍锏沫h(huán)境中近8個(gè)月，當(dāng)進(jìn)行發(fā)芽率試驗(yàn)時(shí)，先對(duì)該批種子進(jìn)行了含水量檢測，發(fā)現(xiàn)其平均含水量是6.59%。利用該批種子測得實(shí)際發(fā)芽率為85%，TTC染色后生活力為90%，其生活力略高于發(fā)芽率，能夠反映油桐種子活力的真實(shí)情況，這與任昱等[14]、李成忠等[15]和韓春艷等[16]的研究結(jié)果一致。采用TTC法測定油桐種子的生活力，從浸種到染色結(jié)束，全時(shí)長需要3 d；而常規(guī)發(fā)芽試驗(yàn)，將油桐種子層積沙藏在含水量40%～50%的濕沙中，于黃土中催芽，28 d后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率[8]。如果采用直播育苗方式又恰遇干旱，其萌發(fā)周期更長，從萌發(fā)到結(jié)束長達(dá)3～4個(gè)月。如此漫長的時(shí)間，在生產(chǎn)上預(yù)估需要的種子量就顯得不太實(shí)際。本研究很好地解決了這一生產(chǎn)實(shí)際問題，具有良好的便利性和可操作性。