黃土高原雨養(yǎng)區(qū)苜蓿地土壤微生物功能多樣性研究

程文文，羅珠珠，牛伊寧，蔡 霞

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省干旱生境作物學(xué)省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070)

微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組分[1]，在參與土壤養(yǎng)分循環(huán)[2]、改善土壤結(jié)構(gòu)[3]、有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)換[4]以及維持生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定方面具有重要的作用。研究表明，土壤微生物參與土壤反應(yīng)的絕大部分進(jìn)程[5]，微生物的分布和活動是土壤環(huán)境與微生物群落相互影響與適應(yīng)的結(jié)果[6]。微生物在一定程度上能反映土壤環(huán)境，更早地指示生態(tài)系統(tǒng)功能的變化，可以作為評價土壤環(huán)境質(zhì)量的重要參數(shù)[7]。因此，微生物在農(nóng)業(yè)土壤生態(tài)系統(tǒng)中的作用愈發(fā)突出。土壤微生物多樣性的研究方法很多，GARLAND等[8]首次應(yīng)用Biolog生態(tài)微平板描述微生物的群落功能特征，該方法通過檢測土壤微生物對單一碳源的利用方式的差異，進(jìn)而表征環(huán)境中各個類型的土壤微生物代謝等方面的功能多樣性，用來預(yù)估評價土壤質(zhì)量與不同耕作栽培措施之間的響應(yīng)[9]。

黃土高原半干旱區(qū)是我國重要的雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū)，干旱少雨、水土流失嚴(yán)重是該區(qū)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要限制因素[10]。除了特殊的地形地勢、黃土抗蝕能力差、植被覆蓋度低、降雨分配不均等自然原因外[11]，傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)對土地的不合理利用是導(dǎo)致嚴(yán)重水土流失的人為原因之一[12]。黃土高原丘陵溝壑區(qū)長期以小麥(TriticumaestivumL.)為當(dāng)?shù)刂匾募Z食作物，以小麥單作為主的傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)系統(tǒng)極易引起水土流失，導(dǎo)致土壤質(zhì)量退化。紫花苜蓿(Medicagosativa)根系周圍環(huán)境土壤中的微生物具有較好的根瘤固氮作用，同時由于苜蓿本身的生長特性，收割之后地上部分還擁有大量可以供給作物生長需要的殘茬，地下部分大量的須根給土壤留下的腐殖質(zhì)可增加土壤有機(jī)質(zhì)[13]，改善土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)[14]。苜蓿在黃土高原半干旱區(qū)的可利用價值受到廣泛關(guān)注，但是持續(xù)種植多年后苜蓿產(chǎn)量會下降，制約農(nóng)業(yè)的綠色環(huán)保與可持續(xù)發(fā)展[15]。

目前，苜蓿連續(xù)種植多年導(dǎo)致的產(chǎn)草量下降和土壤干燥化現(xiàn)象已經(jīng)引起重視，國內(nèi)學(xué)者圍繞苜蓿在不同生態(tài)區(qū)種植與發(fā)展對土壤水分變化特征的影響進(jìn)行了深入研究[16-18]，長期種植苜蓿對土壤理化性質(zhì)的變化方面亦有報道[19-22]。但是，關(guān)于苜蓿土壤微生物研究相對較少。因此，依托黃土高原雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū)的長期定位試驗(yàn)，分析探討土壤微生物多樣性與苜蓿種植年限之間的關(guān)系，研究結(jié)果可用來評價苜蓿土壤肥力狀況，做到健康管理土壤微生物，亦可以指導(dǎo)黃土高原雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)系統(tǒng)苜蓿人工草地的可持續(xù)利用，促進(jìn)當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)依托設(shè)于位于溫帶干旱少雨地區(qū)的甘肅省定西市甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)長期定位試驗(yàn)(2002—2016年)。年均太陽輻射592.9 kJ/cm2，年平均日照時長2 476.6 h，年均降水390.9 mm，地面降水年蒸發(fā)量1 531 mm，日平均氣溫6.4 ℃，滿足作物生長的有效積溫2 239.1 ℃，全年無霜期140 d。

1.2 研究方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取種植年限分別為6、13、15 a的紫花苜蓿人工草地和農(nóng)田為研究對象(處理)，不同種植年限苜蓿生長期間均未施肥、灌水，且各小區(qū)面積均為21.0 m2(3.0 m ×7.0 m)，不同種植年限的苜蓿取3次重復(fù)，得出各處理的平行值。

1.2.2 土壤樣品的采集與測定 于苜蓿盛花期，用5點(diǎn)取樣法在每個測定的試驗(yàn)小區(qū)作物行間采集0～30 cm和30～60 cm土壤深度樣品，并剔除土樣中的植物根系、落葉、石塊等雜物，隨后將土樣混合均勻，過篩(0.25 mm)。將用于測定土壤微生物量碳(MBC)含量和微生物功能多樣性的土樣放置在4 ℃冰箱中避光保存；同時預(yù)留配套的土樣，風(fēng)干研磨之后，用于測定土壤有機(jī)碳(SOC)含量。

SOC含量采用外加熱重鉻酸鉀法測定[23]，MBC含量采用氯仿熏蒸浸提法測定[24]。使用Biolog生態(tài)微平板(Biolog eco plate TM)測定土壤微生物功能多樣性等相關(guān)指標(biāo)[25]。

1.2.3 計(jì)算方法 平均顏色變化率(AWCD)值可以解釋土壤微生物對碳源利用程度的差異，是衡量微生物代謝活性的指標(biāo)。計(jì)算公式如下：

AWCD=∑(Ci-R)/n

(1)

式中：Ci為各反應(yīng)孔在590、750 nm下的光密度值之差；R為生態(tài)微平板對照孔的光密度值；在計(jì)算中，Ci-R為負(fù)值時，該孔的結(jié)果記為0，即Ci-R的值均大于或等于0[26]；n=31。

土壤微生物群落功能多樣性可以借助Shannon-Wiene物種多樣性指數(shù)(H)、均勻度指數(shù)(U)和碳源利用豐富度指數(shù)(S)來表征，計(jì)算公式如下[27-28]：

H=-∑Pi×ln(Pi)

(2)

(3)

式中：Pi為第i孔的相對吸光值與平板所有反應(yīng)孔相對吸光值總和的比率，即Pi=(Ci-R)/∑(Ci-R)；ni為第i孔的相對吸光值；S采用反應(yīng)孔(吸光值>0.2，則代表該孔的碳源被利用，該孔為反應(yīng)孔)的數(shù)目表示[29-30]。

將Biolog生態(tài)微平板中95種碳源分為6類，反映土壤微生物群落利用各類碳源的特征，其中，各類碳源占碳源總數(shù)的比例即碳源利用率。

1.2.4 主成分分析(PCA) 載荷因子反映了微生物對土壤碳源利用情況和所提取主成分之間的相關(guān)性。載荷因子是正的，說明兩者正相關(guān)，反之亦然。碳源的初始載荷因子絕對值越大，說明該碳源對主成分的影響越大。本研究選取荷載因子絕對值大于0.5的碳源作為與主成分1(PC1)和主成分2(PC2)顯著相關(guān)的碳源[31]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，用Origin 8.0制圖，用SPSS 21.0軟件進(jìn)行方差顯著性分析、主成分分析。利用主成分分析衡量微生物對不同碳源的利用情況[32]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同年份苜蓿種植和農(nóng)田土壤SOC、MBC含量

由圖1可知，隨著土壤深度的增加，SOC與MBC含量均呈現(xiàn)下降趨勢。SOC含量在0～30 cm土壤深度內(nèi)表現(xiàn)為13 a>6 a>農(nóng)田>15 a，13 a與6 a之間SOC含量差異不顯著，但是與15 a之間差異顯著；SOC含量在30～60 cm土壤深度下呈現(xiàn)出6 a>農(nóng)田>15 a>13 a，6 a與13 a以及15 a之間差異顯著，13 a與15 a之間差異不顯著，6 a SOC含量比13 a提高48.08%，比15 a提高45.84%。在土壤深度0～60 cm內(nèi)，MBC含量均呈現(xiàn)出6 a>13 a>15 a>農(nóng)田，6 a與13、15 a之間差異顯著，13 a與15 a之間差異不顯著，6 a比13 a提高37.47%～38.16%，比15 a提高47.81%～54.40%。

不同小寫字母分別表示相同土壤深度下不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同

2.2 不同年份苜蓿種植和農(nóng)田土壤微生物AWCD值

由圖2可知，AWCD值隨著培養(yǎng)時間的延長而增加。各處理的AWCD值在0～24 h內(nèi)幾乎無變化，表明此時間段內(nèi)微生物基本未利用碳源，未開始自身的代謝活動。在24 h之后，微生物開始逐步利用碳源，AWCD值迅速提高，微生物進(jìn)入迅速增長時期，進(jìn)入一種理想化的增長模式，即為生態(tài)學(xué)上所提及的對數(shù)增長期，呈“J”形增長曲線(24～144 h)。當(dāng)144 h之后，曲線開始漸漸的趨于平滑。不論何種處理，隨著土壤深度的加深，AWCD值降低。同時發(fā)現(xiàn)，土壤深度0～30 cm時，培養(yǎng)時間120～192 h時，AWCD值表現(xiàn)為6 a最高，農(nóng)田和13 a居中，15 a較低，體現(xiàn)了較強(qiáng)的碳源的利用能力；土壤深度30～60 cm時，AWCD值整體表現(xiàn)為6 a最高，13、15 a居中，農(nóng)田最低。

a:土壤深度0～30 cm;b:土壤深度30～60 cm，下同a:Soil depth af 0—30 cm; b:Soil depth of 30—60 cm,same below

2.3 不同年份苜蓿種植和農(nóng)田土壤微生物碳源利用率

由圖3可知，苜蓿種植土壤和農(nóng)田土壤微生物對碳源利用情況有所不同，土壤深度0～30 cm和30～60 cm，農(nóng)田土壤微生物碳水化合物類(50.68%、51.53%)、羧酸類(21.01%、21.89%)利用率較高；苜蓿種植土壤碳水化合物類和氨基酸類利用率較高，其中，土壤深度0～30 cm，碳水化合物類和氨基酸類利用率分別為40.50%～45.54%、20.66%～23.61%，土壤深度30～60 cm，碳水化合物類和氨基酸類利用率分別為38.90%～41.45%、19.66%～21.31%。種植苜蓿降低了土壤微生物對碳水化合物類和羧酸類的利用率，增加了氨基酸類、聚合物類、酚酸類和胺類的碳源利用率。同時發(fā)現(xiàn)，農(nóng)田土壤微生物所利用碳源的一半以上來源于碳水化合物類，土壤深度30～60 cm酚酸類和胺類(0.44%、0.92%)利用率較少，這可能是由于農(nóng)田土壤微生物類群相對單一所致。

圖3 苜蓿種植和農(nóng)田土壤微生物碳源利用率 Fig.3 Utilization ratio of soil microbial carbon sources of farmland and alfalfa planting soil

2.4 不同年份苜蓿種植和農(nóng)田土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)

由表1可知，土壤微生物培養(yǎng)120 h，H、U和S以及AWCD值均隨土壤深度增加而逐漸變小，表明微生物活動的代謝能力減弱。土壤深度0～30 cm，H、U、S值處理間差異不顯著；土壤深度30～60 cm，H、S值均表現(xiàn)為6 a最高，其中，6、13 a的S值與15 a之間差異顯著，苜蓿種植土壤與農(nóng)田土壤間差異顯著。各處理AWCD值在0～30 cm土壤深度無顯著差異；30～60 cm土壤深度表現(xiàn)為6 a最高，與農(nóng)田土壤差異顯著。同時可以看出，隨著苜蓿種植年限的增加，各土層H、U值均減小，表現(xiàn)為6 a>13 a>15 a。

表1 苜蓿種植和農(nóng)田土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)Tab.1 Functional diversity index of soil microbial communities of framland and alfalfa planting soil

2.5 不同年份苜蓿種植和農(nóng)田土壤微生物群落功能多樣性的主成分分析

用PCA法對土壤微生物群落的碳源利用情況分析，了解不同苜蓿種植年限土壤微生物群落功能多樣性。根據(jù)此原則，在0～30 cm土壤深度的31個因子中提取了7個主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率為93.90%，其中PC1為48.26%，權(quán)重最大，PC2次之，為14.60%，PC3—PC7較小；在30～60 cm土壤深度提取了8個主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率為95.59%，其中，PC1為35.98%，權(quán)重最大，PC2次之，為17.73%，PC3—PC8較小?？梢?，前2個主成分可以用來解釋土壤微生物群落功能多樣性差異變化。

由圖4a可知，在PC1軸上，雖然各處理正負(fù)方向均有分布，但6 a主體在正方向，農(nóng)田、13 a和15 a主體在負(fù)方向；在PC2軸上，農(nóng)田分布在負(fù)方向，得分-0.29～-3.44，其余處理基本分布在正方向，得分-1.68～5.56。由圖4b可知，在PC1軸上，6 a均分布在負(fù)方向，農(nóng)田和13 a均分布在正方向，15 a雖然正負(fù)方向均有分布，但主體基本分布在負(fù)方向；在PC2軸上，6 a均分布在負(fù)方向，農(nóng)田雖然正負(fù)方向均有分布，但主體基本分布在負(fù)方向，13 a和15 a均分布在正方向。從圖4a可以看出,0～30 cm

圖4 苜蓿種植和農(nóng)田土壤微生物碳源利用主成分分析Fig.4 Principal component analysis of soil microbial carbon sources of farmland and alfalfa planting soil

土壤深度農(nóng)田投射點(diǎn)分布在第三、四象限，其余處理投射點(diǎn)大多分布在第一、二象限；從圖4 b可以看出,30～60 cm土壤深度6 a投射點(diǎn)分布在第三象限，農(nóng)田投射點(diǎn)主要分布在第四象限，其余處理投射點(diǎn)均分布在第一、二象限。這表明不同處理土壤微生物群落功能多樣性出現(xiàn)分異，對各類碳源的喜好不一。

從表2可知，在0～30 cm土壤深度，PC1載荷因子絕對值在0.5以上的有14種，主要包括碳水化合物類(4種)、氨基酸類(4種)、羧酸類(4種)、胺類(1種)、酚酸類(1種)，PC2載荷因子絕對值在0.5以上的僅有5種，包括碳水化合物類(1種)、氨基酸類(1種)、羧酸類(1種)、酚酸類(1種)、聚合

表2 31種碳源的主成分分析載荷因子Tab.2 Loading factors of principle components of 31 substrates sole-carbon sources

物類(1種)。說明碳水化合物類、氨基酸類、羧酸類是0～30 cm土壤深度土壤微生物利用的主要碳源類型。在30～60 cm土壤深度，PC1載荷因子絕對值在0.5以上的碳源有19種，主要包括碳水化合物類(6種)、氨基酸類(5種)、聚合物類(3 種)、羧酸類(2種)、酚酸類(2 種)、胺類(1種)；PC2載荷因子絕對值在0.5以上的碳源僅有7 種，包括碳水化合物類(3種)、氨基酸類(2種)、聚合物類(1種)、羧酸類(1種)。說明碳水化合物類、氨基酸類、聚合物類是30～60 cm土壤深度土壤微生物利用的主要碳源類型。

3 結(jié)論與討論

土壤碳組分是評價土壤環(huán)境質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，其在改善土壤結(jié)構(gòu)、減輕水土流失、維持植物營養(yǎng)的有效性方面具有重要作用。不同作物類型下土壤由于受來自植物的凋落物[33]、根系分泌物[34]等物質(zhì)的質(zhì)量和數(shù)量不同[35]，土壤有機(jī)碳組分分布情況不同。本研究中，SOC、MBC含量均表現(xiàn)為6 a顯著高于15 a，由于紫花苜蓿為多年生植物，隨著種植時間延長，地上生物量逐漸增加，進(jìn)而導(dǎo)致枯枝落葉和根系分泌量增加，提高了土壤中的SOC和MBC含量，為微生物的生長與繁殖提供了充足的碳源[13-14]，當(dāng)苜蓿種植超過一定年限后，土壤環(huán)境惡化，板結(jié)嚴(yán)重，土壤孔隙度降低，不再適宜于微生物的生存與繁殖，此外地上生物量減少，使得固定到土壤中的碳素減少，呈現(xiàn)出MBC含量降低的趨勢[36]。

AWCD值反映土壤微生物利用碳源的能力和代謝活性的大小[37-38]，在一定程度上能反映土壤中微生物種群的數(shù)量和結(jié)構(gòu)特征[39]。AWCD值的結(jié)果表明，在培養(yǎng)中期(24～144 h)，土壤微生物對碳源利用強(qiáng)度不斷增強(qiáng)。培養(yǎng)后期(144 h之后)，微生物對碳源的利用趨于穩(wěn)定狀態(tài)，存在較明顯的適應(yīng)期、對數(shù)期和穩(wěn)定期等階段，符合一般微生物利用基質(zhì)的規(guī)律[40]。本研究發(fā)現(xiàn)，伴隨土壤深度的增加，AWCD值降低，微生物自身代謝活動受到抑制。苜蓿為多年生草種，根系發(fā)達(dá)，隨著苜蓿種植時間的延長到達(dá)旺盛期后地表覆蓋物不斷增加，凋落物和根系分泌量增加，促進(jìn)微生物繁殖，此時苜蓿根瘤菌的固氮作用較強(qiáng)，使土壤有機(jī)碳和養(yǎng)分含量增加[41-42]，影響土壤微生物代謝活性。但當(dāng)苜蓿種植年限達(dá)到一定的階段，土壤板結(jié)問題日益嚴(yán)重，導(dǎo)致土壤中的孔隙度降低，空氣含量亦下降，生存條件惡化導(dǎo)致微生物總體活性下降[36]。而農(nóng)田土壤作物根系不發(fā)達(dá)，微生物活性明顯弱于苜蓿地，使其土壤微生物代謝活性低于苜蓿土壤。

H、U、S值能代表土壤微生物利用碳源的能力以及多樣性，是分析群落功能多樣性的重要指數(shù)[43]。H值越高，表明所含物種越豐富；U值越高，表明群落均一程度越高；S值越高，表明可利用碳源種類越多[44]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著苜蓿種植年限增加，H、U值均呈下降趨勢，0～30 cm和30～60 cm土壤深度2種指數(shù)并未表現(xiàn)出明顯差異；但30～60 cm土壤深度， H、S值表現(xiàn)為6、13 a與農(nóng)田差異顯著。苜蓿屬密集型草本，地面附著物效果好，可保水，長期種植苜蓿且未翻耕，植物殘體落葉等進(jìn)入土壤轉(zhuǎn)化為腐殖質(zhì)，使有機(jī)物質(zhì)含量提高，為微生物的生長和繁殖提供了充足的底物[45]，因此土壤微生物豐富度增加。苜蓿種植年限長達(dá)15 a以后開始減產(chǎn)，養(yǎng)分含量降低與生長衰退同時發(fā)生[36]，有機(jī)物質(zhì)的減少使微生物豐富度隨之減少。

植被通過影響土壤環(huán)境而改變土壤微生物生長環(huán)境，土壤微生物碳源代謝類型與作物種植體系以及耕作措施有顯著的相關(guān)性[46]。本研究發(fā)現(xiàn)，種植苜蓿降低了土壤微生物對碳水化合物類和羧酸類的利用率，提高了氨基酸類、聚合物類、酚酸類和胺類的利用率。同時發(fā)現(xiàn)，農(nóng)田土壤微生物利用碳水化合物類較多，但對聚合物類、酚酸類和胺類的利用率相對較低，特別是土壤深度30～60 cm。這種差異主要源于不同種植體系引起土壤性質(zhì)發(fā)生改變，土壤微生物與土壤團(tuán)聚體數(shù)量及質(zhì)量之間存在密切聯(lián)系，而土壤團(tuán)聚體的改變與土壤環(huán)境微生物的遷移與代謝過程緊密相關(guān)[47]。不同種植年限苜蓿土壤長期以來一直未進(jìn)行耕作擾動，而農(nóng)田土壤由于種植一年生糧食作物需要連年耕作，耕作后土壤團(tuán)聚體數(shù)量和直徑遠(yuǎn)小于未耕作的土壤[48]，耕作措施改變土壤結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響到土壤微生物群落特征[47]。而且，不同作物對土壤微生物群落的影響不同[49]，不同作物的根系分泌物可能使土壤微生物對某些碳源的利用能力有一定的抑制作用，使某些碳源利用能力消弱，這與有利于利用此類碳源的土壤微生物數(shù)量減少有一定關(guān)系。

主成分分析可用來解釋不同處理土壤微生物碳源利用是否存在差異。土壤深度0～30 cm和30～60 cm各處理土壤微生物對碳源的利用出現(xiàn)了較好的分離，碳源的代謝表現(xiàn)出明顯變化。6 a比較集中在某一特定區(qū)域，而其他2個種植年限分布較分散，說明6 a土壤微生物代謝功能性較好，對碳源的利用情況較穩(wěn)定。不同種植年限苜蓿改變土壤微生物群落功能多樣性是由微生物對PC1和PC2上載荷較高的碳源利用差異引起的，土壤深度0～30 cm在PC1和PC2上載荷較高的主要碳源為碳水化合物類、氨基酸類、羧酸類；土壤深度30～60 cm在PC1和PC2上載荷較高的主要碳源為碳水化合物類、氨基酸類、聚合物類，說明這3類碳源可作為不同種植年限土壤微生物碳源利用的敏感碳源。

Biolog生態(tài)微平板方法只能檢測土壤中快速生長或富營養(yǎng)微生物的活性，而不能用來解釋絕大部分土壤中其他類型的微生物活性[31]，因此采用Biolog生態(tài)微平板方法來研究土壤微生物群落的代謝及相關(guān)生理生化過程可能存在一些偏差。因此，今后的研究應(yīng)進(jìn)一步將Biolog生態(tài)微平板法與16S rDNA方法結(jié)合起來，并結(jié)合冗余分析(RDA)和典型相關(guān)分析(CCA)等方法，以期為黃土高原雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)系統(tǒng)苜蓿草地的可持續(xù)利用與當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)的發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。