單環(huán)刺螠浮游幼體饑餓實驗及不可逆生長點的確定

文/丁勇 李赟 孫陽 劉彤 陳文博 張賽賽 宋曉陽 陳穎 張玢

單環(huán)刺螠（Urechis unicinctus）隸屬螠蟲動物門、螠綱、無管螠目、刺螠科、刺螠屬。生活在海邊潮間帶，我國主要分布在黃海、渤海沿岸，在當?shù)厮追Q海腸，是一種經濟價值較高的海產品種，現(xiàn)階段市場零售價格能達到320元/kg，是漁業(yè)經濟品種中重要的捕撈對象。

饑餓是海洋生物在自然水域生態(tài)系統(tǒng)中經常面臨的一種生理現(xiàn)象，也是影響海洋生物正常生長、發(fā)育及生存的一個重要環(huán)境因子。王慶志等認為饑餓條件對魁蚶眼點幼蟲占幼蟲總數(shù)比例有一定影響，隨著饑餓時間延長，幼蟲發(fā)育變慢，一直饑餓會導致生長停滯。單環(huán)刺螠浮游幼體內源性營養(yǎng)時間很短，幼體主動攝食能力很強，需要盡快對其進行投餌才能完成幼體從內源性營養(yǎng)向外源性營養(yǎng)期的轉化，以維持正常的早期發(fā)育生長。刺參、扇貝等浮游幼體受自身的形態(tài)發(fā)育、生理狀態(tài)以及環(huán)境因子影響，容易出現(xiàn)攝食器官發(fā)育遲緩、游泳器官機械損傷和幼體變態(tài)等可引發(fā)饑餓死亡的問題，導致后期浮游幼體生長遲緩，死亡率陡增。單環(huán)刺螠浮游幼體的相關研究未見報道。

近年來由于過度捕撈等原因，單環(huán)刺螠數(shù)量急劇下降，很多傳統(tǒng)的產地已經捕撈不到單環(huán)刺螠。同時由于近幾年刺參育苗行業(yè)慘淡，越來越多的養(yǎng)殖戶放棄刺參育苗，導致大量工廠化育苗車間一直處于閑置狀態(tài)。為保護大連本地特有的單環(huán)刺螠種質資源，同時能夠將閑置的工廠化育苗車間利用，推進農業(yè)現(xiàn)代化的科技供給側改革，促進產業(yè)轉型升級，本項目探索了單環(huán)刺螠工廠化生態(tài)養(yǎng)殖模式。本文主要探討?zhàn)囸I環(huán)境對單環(huán)刺螠浮游幼體生長的影響，并初步確定單環(huán)刺螠浮游幼體PNR（不可逆點）。

一、材料與方法

（一）浮游幼體及培育條件

1.初孵浮游幼體來源

2019年5月，于大連市金普新區(qū)蕎麥山海區(qū)捕撈種螠，清洗干凈表面后解剖，人工授精獲得受精卵，于孵化池中充氣孵化出擔輪幼蟲。

2.浮游幼體培育條件

初孵浮游幼體于80L圓柱形水桶中培育，砂濾海水，鹽度30～31，溶解氧8.4mg/L～8.9mg/L，水溫18.0℃～19.5℃，pH7.9～8.0。白天為自然光，光強范圍為200lx～1000lx。每天記錄水桶內水溫，吸底換水一次，換水量50%。晝夜以微充氣飼養(yǎng)。觀察浮游幼體的生活習性及生長發(fā)育變化。

3.餌料

實驗用餌料為新月藻、角毛藻和海洋紅酵母，混合投喂。

（二）方法

1.浮游幼體饑餓實驗

取當天孵化擔輪幼蟲，分別放養(yǎng)于標號為A、B、C的三個80L的水桶中。從擔輪幼蟲開口攝食前一天開始，每天定時往A水槽中投喂新月藻、角毛藻和海洋紅酵母，使水槽中餌料密度保持在正常濃度，作為正常生長擔輪幼蟲。B、C水槽內不投喂任何餌料，作為饑餓擔輪幼蟲。每個水桶的擔輪幼蟲放養(yǎng)密度為6個/mL，每個水桶放養(yǎng)總個數(shù)48萬個。

每天隨機分別從A、B兩個水槽中各取擔輪幼蟲10個，在顯微鏡下測量并記錄其體長、體高、胃徑。體積在擔輪幼蟲發(fā)育過程中為橢球形。體積計算公式為：V=(4/3)·π·(R/2)2·L/2，其中R為體高，L為體長。

2.初次攝食率和初次攝食強度

表1 攝食組和饑餓組單環(huán)刺螠浮游幼體測量表

單環(huán)刺螠擔輪幼蟲開口后每天從C水桶中取擔輪幼蟲20個，放入有效水體為40mL的透明塑料瓶中，不充氣（單環(huán)刺螠耐低氧），投喂一定量新月藻、角毛藻和海洋紅酵母，測定波長427nm下吸光光度值作為初始光度值。1h后將擔輪幼蟲全部取出，在顯微鏡下逐一觀察個擔輪幼蟲的攝食情況，同時測量計算吸光光度值，計算初次攝食率和初次攝食強度，初次攝食率=攝食擔輪幼蟲數(shù)/樣本擔輪幼蟲數(shù)×100%。每天從C組中取20個幼體于40mL透明塑料瓶中記C1，另一空40mL透明塑料瓶記C2。C1投餌后立刻測吸光值查詢濁度記N1初，1h后測吸光值查詢濁度記N1末，△N1=N1初-N1末。同理得△N2=N2初-N2末，初次攝食強度F=△N=△N1-△N2。

3.PNR（不可逆點）的確定

單環(huán)刺螠浮游幼體PNR確定，以單環(huán)刺螠孵化后日齡表示，每日測定饑餓組單環(huán)刺螠擔輪幼蟲的初次攝食率，當所測定的饑餓組擔輪幼蟲的初次攝食率低于最高初次攝食率的一半時，即為PNR（不可逆點）的時間。

（三）數(shù)據(jù)處理與計算

實驗所得數(shù)據(jù)用SPSS17.0進行統(tǒng)計分析，結果以平均值±標準誤表示。比較饑餓組擔輪幼蟲與攝食組擔輪幼蟲的生長指標采用t檢驗方法，以P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，用Excel2007運算并繪圖。

二、結果

（一）攝食組和饑餓組單環(huán)刺螠浮游幼體生長的變化

在培育水溫為18.0℃～19.5℃條件下，初孵浮游幼體體長（173.8±10.5）μm，體高（157.7±7.4）μm，胃徑（48.6±7.1）μm。初孵浮游幼體游泳能力相對較弱，漂浮于水體表層，依靠體中部一圈纖毛環(huán)擺動進行運動。口位于體中部纖毛環(huán)初，消化道未分化。軀體呈橢球狀。浮游幼體孵出后第2d開口攝食。15日齡饑餓組浮游幼體全部死亡。由表1可以看出饑餓組浮游幼體與攝食組浮游幼體在0～1日齡體長、體高及胃徑變化差異均不明顯，攝食組浮游幼體攝食后第2d開始加速增長，與饑餓組相比差異極顯著（P＜0.01）在攝食后的第7d，浮游幼體的體長和體高增長顯著，與初孵浮游幼體相比分別增長了（232±10.5）μm和（96±7.4）μm，而與此對應的饑餓組浮游幼體的體長和體高分別增長了（66±5.2）μm和（82±4.8）μm。隨著日齡增長，攝食組與饑餓組浮游幼體發(fā)育程度也不同，9日齡時，攝食組浮游幼體出現(xiàn)體環(huán)紋，開始發(fā)育至體節(jié)幼蟲。而饑餓組浮游幼體直到15日齡，幼體全部死亡也未出現(xiàn)體環(huán)紋，未能發(fā)育到體節(jié)幼蟲。隨著饑餓時間的持續(xù)，饑餓組浮游幼體生長減慢、停止直至死亡。

（二）浮游幼體體積變化

浮游幼體的體積隨日齡增加而先增加后減小（圖1），初孵擔輪幼蟲的體積為2028174μm3，隨著幼體的發(fā)育，攝食組體積增長很快，饑餓組體積增長緩慢。由圖1可以看出，在18.0℃～19.5℃的條件下，5日齡到9日齡體積增長速度最快，10日齡開時體積開始減小，到實驗結束時15日齡攝食組幼體體積8040022μm3，饑餓組幼體體積2313109μm3。9日齡擔輪幼蟲腹部分節(jié)明顯，進入體節(jié)幼蟲，體積開始逐漸減小。

（三）浮游幼體初次攝食率與PNR的確定

浮游幼體初次攝食率變化如圖2所示。浮游幼體孵化后第二天開始攝食，也就是開始饑餓實驗后第1d，此時浮游幼體初次攝食率為100%，一直維持在這個水平。直至第12日齡初次攝食率才開始下降95%，至第15日齡初次攝食率達到0%。根據(jù)PNR點定義，孵化后第15日齡，也就是饑餓15d，進入PNR期。圖3為浮游幼體隨著饑餓天數(shù)增加攝食能力的變化趨勢。饑餓7d內，仔魚攝食能力提高，饑餓7d后，仔魚攝食能力降低。

三、討論

（一）饑餓對單環(huán)刺螠浮游幼體生長及形態(tài)發(fā)育的影響

浮游幼體的生長發(fā)育除自身遺傳性外，會受到一系列外界因素的影響，外源營養(yǎng)是其中重要的影響因子，外源營養(yǎng)缺乏會直接導致浮游幼體生存能力減弱，成活率降低。如果浮游幼體長期處于饑餓狀態(tài)，則生長將會受到很大影響。饑餓后單環(huán)刺螠浮游幼體出現(xiàn)纖毛環(huán)萎縮，體壁皺縮，體高比攝食組低，體長比攝食組短，胃徑比攝食組小，這與哲羅魚、中華絨螯蟹、曼氏無針烏賊等海洋經濟生物幼體饑餓實驗結果基本相同。在螠蟲類饑餓方面，目前國內外有關饑餓發(fā)育的研究較少。本實驗測定了饑餓和攝食條件下單環(huán)刺螠生長的變化及發(fā)育狀況。由結果可以看出，饑餓對其幼體的發(fā)育和攝食均有很大影響，海洋生物幼體階段餌料充足是滿足幼體正常生長發(fā)育的重要因子。

（二）初次攝食率與PNR

不同種類海洋生物幼體的初次攝食時間差異很大，冷水魚類太平洋鱈仔魚在破膜后第5日齡開始攝食，比高溫魚類黃鯛的4日齡、黑鮸的3日齡、大黃魚的3日齡、囊鰓鯰3日齡晚，原因可能與溫度有關。單環(huán)刺螠產卵孵化溫度為18℃，溫度較高，并且生物相對低等，消化結構簡單，所以浮游幼體初次攝食時間更早。

攝食率的高低和最高攝食率持續(xù)的長短可以用來判斷幼體的攝食能力，而PNR可以判定幼體耐受饑餓的能力。單環(huán)刺螠的最大初次攝食率為100%，出現(xiàn)在第2日齡，保持了近10d時間，與金烏賊仔烏PNR9.5d情況接近，而三疣梭子蟹的PNR出現(xiàn)在39h，這主要是受物種類別和溫度的影響。

餌料是否充足將決定生物體后期的變態(tài)發(fā)育，甚至生長和存活，在最為恰當?shù)臅r期進行合理投喂是十分必要的。由以上結果可以說明單環(huán)刺螠的攝食能力和耐饑餓能力很強。在人工育苗過程中，較強的耐饑餓能力能大大提高浮游期人工育苗的成活率，為探索成本最低的餌料配方提供了依據(jù)。單環(huán)刺螠開口較早，及時投喂餌料，確保初孵幼體盡快吃到食物，降低人工養(yǎng)殖過程中的死亡率，才能創(chuàng)造更大的經濟效益。

（三）初次攝食最佳投喂時間

海洋生物幼體的攝食能力和耐饑餓能力需要掌握好，在人工育苗投喂適口天然餌料時，過早、過晚和過量投喂都會導致浮游幼體出現(xiàn)生長發(fā)育問題，甚至明顯大量死亡。單環(huán)刺螠浮游幼體耐饑餓能力較強，開口攝食時間早，在18.0℃～19.5℃的條件下，單環(huán)刺螠擔輪幼蟲孵出后第2d即開口攝食，混合營養(yǎng)期很短，為1d。在混合營養(yǎng)期階段，必須及時滿足其外源性營養(yǎng)的需求，補充正常生理活動所需的餌料。若在此時期得不到食物，幼體后期的生長發(fā)育會受到明顯影響。因此，單環(huán)刺螠浮游幼體最佳投喂時間為2日齡。