響應(yīng)曲面法優(yōu)化固腎解毒膠囊提取工藝及其對糖尿病腎病大鼠腎功能的影響研究

趙藝丹，張 蕾，劉 娟，楊智睿，孟祥樂，鄢 丹

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院 臨床合理用藥生物特征譜學(xué)評價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，北京 100038；2.河南大學(xué) 藥學(xué)院，河南 開封 475000；3.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州450000）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是與糖代謝相關(guān)的慢性微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎病的重要原因[1]，其發(fā)病率高達(dá)21.3 %[2]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥以整體調(diào)節(jié)、辨證論治的方法治療糖尿病腎病，具有獨(dú)特的優(yōu)勢，可有效延緩DN進(jìn)程[3]。但是目前治療DN具有良好療效的中藥成方制劑品種仍較少，因此研制開發(fā)治療DN的中藥制劑有重要意義[4]。

固腎解毒膠囊（Gushen Jiedu Capsules，GSJD）是根據(jù)醫(yī)療機(jī)構(gòu)協(xié)定處方固腎解毒方研制而成的醫(yī)院制劑，此方源于南宋洪遵《洪氏集驗(yàn)方》“水陸二仙丹”，由芡實(shí)、金櫻子、黃連、大黃、黃芪和當(dāng)歸等六味中藥組成。方中芡實(shí)、金櫻子補(bǔ)腎固澀為君，黃連、大黃清熱解毒、降濁祛血瘀為臣，佐以黃芪、當(dāng)歸補(bǔ)氣養(yǎng)血活血，諸藥合用具有補(bǔ)腎降濁、解毒祛瘀之功效，適用于腎陽虛的DN患者[3-4]。多年臨床研究表明，固腎解毒方對DN療效確切，可有效阻止早期DN發(fā)展至中晚期[5-6]。而研制GSJD首要及關(guān)鍵步驟是提取工藝，藥物具有良好的療效也與提取工藝的可行性緊密相關(guān)。

本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以鹽酸小檗堿提取量為指標(biāo)，采用響應(yīng)曲面法[7]優(yōu)化GSJD的提取工藝參數(shù)；同時(shí)采用糖尿病腎病大鼠模型進(jìn)一步評價(jià)提取工藝可行性，旨在從工藝參數(shù)和腎功能兩方面綜合評價(jià)[8-9]，以便獲得高提取量和具有良好藥效的GSJD提取工藝條件，確定最佳提取工藝參數(shù)，為GSJD的后續(xù)精制工藝奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；BT125D十萬分之一分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；HWS-12型電熱恒溫水浴鍋 (上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；超聲波KQ-600DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；自動生化分析儀Chemray240（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；Nikon Eclipse E200光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司）。

1.2 試藥及實(shí)驗(yàn)動物

鹽酸小檗堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110713-201512，供含量測定用）；乙腈（色譜級，美國Fisher公司）；其他試劑均為分析純；芡實(shí)、金櫻子、黃連、大黃、黃芪、當(dāng)歸（均購于北京金崇光藥業(yè)有限公司）。

Wistar大鼠，雄性，5～6周齡，150～200 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證號：SCXK (京) 2016-0006。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹽酸小檗堿定量測定方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Phenomenex Luna C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長345 nm；柱溫30 ℃；乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（50:50，v/v）（每100 ml中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0） 為流動相；流速1.0 ml/min；進(jìn)樣量10 μl；理論塔板數(shù)按鹽酸小檗堿計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2.1.2 對照品溶液的制備 取鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含90.9 μg的溶液，即得鹽酸小檗堿對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 將芡實(shí)、金櫻子、黃連、大黃、黃芪、當(dāng)歸藥材按（10:10:10:6:10:10）比例加水煎煮，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.14～1.16 （60 ℃）浸膏，取浸膏0.2835 g，精密稱定，置入具塞錐形瓶，精密加入甲醇-鹽酸（100:1，v/v）混合溶液50 ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液2 ml，置入10 ml量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.4 線性范圍考察 精密稱定鹽酸小檗堿適量，加甲醇溶液使每1 ml含鹽酸小檗堿363.60 μg，再以甲醇逐級稀釋為每1 ml含鹽酸小檗堿分別為181.80，118.17，63.63，45.45，18.18 μg對照品溶液。精密吸取系列對照品溶液各10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖并測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，鹽酸小檗堿的濃度 (μg/ml)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：Y=22.521X-30.631（r=0.9999）。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿的濃度在18.18～181.80 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積之間線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取鹽酸小檗堿對照品溶液（90.5 μg/ml）10 μl進(jìn)樣，重復(fù)6次，計(jì)算對照品色譜峰峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，得鹽酸小檗堿峰面積RSD為0.44 %，表明該方法精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μl，分別于配制后0，2，4，6，8 h進(jìn)樣，記錄鹽酸小檗堿峰面積，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，得鹽酸小檗堿峰面積RSD為0.46 %，表明供試品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定，可滿足含量測定需要。

2.1.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批樣品分別6份，按2.1.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法，制備供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測定鹽酸小檗堿含量，計(jì)算各含量間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果RSD為0.42 %，表明所建立的定量測定方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知鹽酸小檗堿含量樣品適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量的鹽酸小檗堿對照品，按2.1.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法，制備供試品溶液，再按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，得鹽酸小檗堿的平均加樣回收率為99.5 %，RSD為1.40 %，表明回收率良好。

2.2 單因素考察

將提取液料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)作為影響因素，以鹽酸小檗堿的提取量為評價(jià)指標(biāo)。

2.2.1 液料比考察 將各味藥材按比例加水煎煮，以固定提取時(shí)間為2 h，提取次數(shù)為2次，分別考察液料比為6:1，8:1，10:1，12:1，14:1對鹽酸小檗堿提取量的影響，結(jié)果鹽酸小檗堿提取量分別為18.05，20.02，17.31，17.12，16.59 mg/g。結(jié)果表明，當(dāng)液料比為8:1時(shí)，鹽酸小檗堿提取量最高，因此初步確定8:1為最佳液料比。

2.2.2 提取時(shí)間考察 將各味藥材按比例加水煎煮，以固定液料比為8:1，提取次數(shù)為2次，分別考察提取時(shí)間為1，2，3，4 h對鹽酸小檗堿提取量的影響，結(jié)果鹽酸小檗堿提取量分別為16.02，19.56，19.82，20.18 mg/g。結(jié)果表明，當(dāng)提取時(shí)間為2 h，鹽酸小檗堿提取量相對較高，2 h后提取量未明顯增加，因此初步確定2 h為最佳提取時(shí)間。

2.2.3 提取次數(shù)考察 將各味藥材按比例加水煎煮，以固定提取液料比為8:1，提取時(shí)間為2 h，分別考察提取次數(shù)為1，2，3次對鹽酸小檗堿提取量的影響，結(jié)果鹽酸小檗堿提取量分別為16.60，19.74，19.98 mg/g。結(jié)果表明，當(dāng)提取次數(shù)為2次，鹽酸小檗堿提取量相對較高，且隨提取次數(shù)增加鹽酸小檗堿的提取量無明顯變化，因此初步確定提取2次為最佳提取次數(shù)。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.3 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)、統(tǒng)計(jì)及結(jié)果分析 根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，利用響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)分析軟件Design-Expert 8.0.6進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，綜合單因素實(shí)驗(yàn)，選?。ˋ） 液料比、（B）提取時(shí)間、（C）提取次數(shù)3個因素，以鹽酸小檗堿提取量（Y）為響應(yīng)值，Box-Behnken設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表1。

2.3.2 方差分析 采用ANOVA分析響應(yīng)面回歸參數(shù)，得到Y(jié)值對A、B、C的二次多元回歸模型方程：Y=20.95+0.75A+0.90B+0.50C-0.85AB+0.43AC-0.60BC-2.90A2-2.62B2-1.50C2，R2=0.9817，結(jié)果見表2。

由表2可見，選用的模型差異極顯著（P＜0.001），表明該2次方程比較顯著；失擬項(xiàng)為P＞0.05，表明失擬不顯著；該方程R2=0.9817，表明對實(shí)驗(yàn)擬合良好，實(shí)驗(yàn)誤差較小，可用該模型對不同條件下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測。

表2 方差分析結(jié)果

2.3.3 響應(yīng)面分析 利用Design-Expert 8.06軟件對表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行2次多元回歸擬合，通過固定3個變量中的2個為中值，把應(yīng)變量與另2個因素?cái)M合為三維曲面圖，以擬合目標(biāo)函數(shù)為數(shù)學(xué)模型，繪制因變量曲面圖，所得到的2次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線圖見圖1。確定最佳提取工藝條件為液料比8.24:1、提取時(shí)間2.13 h、提取次數(shù)2.16次，模型預(yù)測Y值為21.09 mg/g。

圖1 液料比、時(shí)間、次數(shù)因素對鹽酸小檗堿提取量的三維響應(yīng)曲面及等高圖

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證該響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)的可靠性，用實(shí)驗(yàn)中得到的最佳提取工藝條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)。通過響應(yīng)曲面分析出的最佳提取條件將提取工藝條件確定為液料比8:1、提取時(shí)間為2 h、提取次數(shù)為2次，修正后的條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，Y值分別20.73，21.31，20.61 mg/g，平均Y值為20.88 mg/g，RSD值為1.79 %，實(shí)際測得值與理論預(yù)測值相對誤差約為0.99 %。表明本實(shí)驗(yàn)利用響應(yīng)曲面優(yōu)化GSJD提取工藝的模型可靠，有良好的預(yù)測性，所得的提取工藝參數(shù)可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.5 動物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.5.1 動物模型的制備及實(shí)驗(yàn)分組 大鼠購入后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，進(jìn)行基礎(chǔ)狀態(tài)血糖及體重的測定，采用隨機(jī)分組設(shè)計(jì)，按體重分為正常組和造模組。正常組大鼠給予正常飼料，模型組給予高脂飼料。8周后，正常組大鼠以3 ml/kg的劑量腹腔注射0.1 mmoL/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，造模組則按30 mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌素溶液（pH 4.2），4周后造模成功的動物隨機(jī)分為模型組給予蒸餾水10 ml/(kg·d)、福辛普利組（陽性對照組）給藥福辛普利鈉1.05 mg/(kg·d)、GSJD低、中、高劑量組，分別給藥GSJD內(nèi)容物0.12，0.24，0.48 g/(kg·d)、正常組動物歸為正常對照組給予蒸餾水10 ml/(kg·d)，連續(xù)灌胃給藥8周。

2.5.2 血清尿素氮水平檢測 給藥8周后，所有動物用10 %水合氯醛4 ml/kg腹腔麻醉，腹主動脈取血，離心后取血清，用全自動血生化分析儀測定尿素氮，所有檢測結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（）表示，組間差異比較采用單因素方差分析，由統(tǒng)計(jì)軟件GraphPad Prism version 6.01完成，見圖2-a；結(jié)果表明，與正常對照組比較，模型組大鼠尿素氮水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，GSJD高劑量組和福辛普利組連續(xù)灌胃8周DN大鼠血清尿素氮水平顯著降低（P＜0.05）。

圖2 GSJD對大鼠尿素氮水平及腎臟病理組織結(jié)構(gòu)的影響

2.5.3 腎臟病理組織學(xué)檢查 取大鼠腎組織，用4 %多聚甲醛溶液固定，無水乙醇脫水，石蠟包埋，切割制備2～3 mm組織薄片，蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，H&E），光鏡下觀察腎組織病理學(xué)變化，將各實(shí)驗(yàn)組的病理組織學(xué)標(biāo)本置于低倍鏡下觀察DN大鼠腎臟病理組織結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)構(gòu)見圖2-b。正常對照組腎臟組織無明顯異常；模型組可見腎小球硬化，系膜區(qū)擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性；福辛普利組顯示腎小球、腎小管基本恢復(fù)正常；GSJD低劑量組仍可見腎小球硬化，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，改善作用不明顯；GSJD中劑量組腎小球結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，但仍可見部分腎小管上皮細(xì)胞空泡變性；GSJD高劑量組腎小球、腎小管基本正常，與福辛普利治療效果類似。

3 討論

GSJD是由臨床療效確切的醫(yī)療機(jī)構(gòu)協(xié)定處方固腎解毒方研制而成。本研究以鹽酸小檗堿的提取量為考察指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化GSJD的提取工藝參數(shù)，利用Design-Expert 8.0.6軟件預(yù)測鹽酸小檗堿提取量。優(yōu)化的提取工藝條件簡單、快捷，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，鹽酸小檗堿提取量實(shí)測結(jié)果與預(yù)測結(jié)果誤差為0.99 %，表明該提取工藝穩(wěn)定、可靠，具有較好的可行性。在確定最佳提取工藝的基礎(chǔ)上，采用DN大鼠模型評價(jià)本提取工藝的有效性，結(jié)果顯示采用最佳提取工藝制備的GSJD可顯著降低DN大鼠血清尿素氮水平，并對DN大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)病變有一定的改善效果。

本研究旨在探討一種優(yōu)選GSJD提取工藝的模式，得到質(zhì)量可控性好、有效性易于保證的最佳提取工藝參數(shù)。響應(yīng)曲面法在中藥復(fù)方提取工藝、中藥藥對配伍研究、單味藥的提取等方面研究較多，且已較為成熟[10-12]。該方法在考察GSJD提取工藝因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)全面，且考察指標(biāo)經(jīng)多次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明結(jié)果穩(wěn)定可靠，含量相對較高，不失為一種考察中藥復(fù)方提取工藝的有效方法。

雖然以單一成分考察GSJD提取工藝略失偏頗，但本研究結(jié)合藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)綜合評價(jià)GSJD的提取工藝，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，按該提取工藝制備得到的GSJD具有較好的改善DN大鼠腎功能的作用。此評價(jià)方法可為目前中藥及復(fù)方質(zhì)量控制的完善提供依據(jù)，在檢測標(biāo)準(zhǔn)上由傳統(tǒng)的“指標(biāo)性成分”檢測向“活性成分關(guān)聯(lián)藥效”的模式轉(zhuǎn)變，確保中藥制劑的有效性，從而促進(jìn)中藥產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。