母樹年齡、留葉方式和基質(zhì)對千年桐扦插生根的影響

周幼成，鐘秋平，鄒玉玲，田 豐，葛曉寧，曹林青，王金鳳

（中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)實驗中心，江西分宜 336600）

【研究意義】千年桐（Vernicia montana）為大戟科（Euphorbiaceae）油桐屬（Vernicia）落葉喬木，是我國重要的工業(yè)油料樹種，與烏桕、核桃和油茶并稱為中國四大木本油料樹種[1-2]。千年桐種仁含油率達到50%以上，桐油含有較高的不飽和脂肪酸，且具有耐高溫酸堿、絕緣、附著力強、抗凍裂、防水等優(yōu)點，是一種綠色無公害的優(yōu)質(zhì)干性油，常作為涂料用于船舶、家具、半導(dǎo)體等以及汽車的制造[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)，桐油有望開發(fā)成為優(yōu)質(zhì)的生物柴油，目前，工業(yè)能源日趨減少，恢復(fù)生態(tài)環(huán)境已迫在眉睫，千年桐產(chǎn)業(yè)的發(fā)展或可為緩解國家資源緊張做出一定貢獻[6]。千年桐在利用種子萌發(fā)的實生苗進行生產(chǎn)造林時，實生苗生長成林所需周期長，投入成本高，且實生苗易產(chǎn)生遺傳變異不能很好地保持親本優(yōu)良性狀，在一定程度上限制了千年桐產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。無性扦插繁殖能夠高度保持母本優(yōu)良性狀，而且具有操作簡單、成苗快、應(yīng)用廣泛等優(yōu)點，是許多木本樹種快速繁殖的方法之一。

【前人研究進展】目前，關(guān)于千年桐扦插繁殖及生根機理研究進展緩慢[7]，何銳等[8]對大戟科樹種麻瘋樹（Jatropha curcasL.）進行扦插繁殖研究時發(fā)現(xiàn)，麻瘋樹穗條長度、外源激素種類、濃度及處理時間可以顯著影響插穗生根，其中穗條長度為主要影響因素，其次為激素濃度和處理時間；崔永忠等[9]發(fā)現(xiàn)不同長度、不同品種的麻瘋樹穗條對扦插生根及成活有一定影響，質(zhì)量濃度為100～300 mg/L ABT處理可以顯著提高插穗成活率、發(fā)根數(shù)?！颈狙芯壳腥朦c】【擬解決的關(guān)鍵問題】采用3 因素3 水平L9（34）正交試驗設(shè)計，探究母樹年齡、留葉方式和基質(zhì)對千年桐扦插生根的影響，通過調(diào)查不同處理生根指標(biāo)，確定扦插生根的最佳處理組合以及相對應(yīng)的環(huán)境條件；探究留葉方式對千年桐插穗生根過程根系性狀和生理的影響，通過對不同留葉方式插穗生根過程進行形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)和生理學(xué)研究，探究其不定根形成的組織起源和生根類型，了解不同留葉方式插穗生根周期和生根方式的差異，同時，明確內(nèi)源激素和相關(guān)營養(yǎng)物質(zhì)與插穗愈傷組織和不定根形成之間的響應(yīng)機制，為千年桐扦插快繁及引種馴化提供科學(xué)理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于中國林科院亞林中心的試驗大棚中進行（27°48′40″N，114°39′37″E），大棚具有自動化噴霧等設(shè)施，苗床用黃泥土和少量河沙填充，四周用磚塊砌實，上方3.5 m處覆蓋遮陽網(wǎng)。當(dāng)?shù)貧夂蝾愋蜑閬啛釒Ъ撅L(fēng)性濕潤氣候，土壤為紅壤，年均降水量約為1 650 mm，平均海拔82 m，年均氣溫15.60 ℃，極端高溫為40.2 ℃，全年無霜期約為265 d。

1.2 試驗設(shè)計

千年桐葉片聚生于枝頂，頂端優(yōu)勢明顯，頂芽抑制側(cè)芽的生長，預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)不帶有新生芽和葉片的插穗難以生根，需要對枝條進行不同留葉處理。插穗均采自千年桐良種示范林的半木質(zhì)化春梢，將插穗剪為8～10 cm 每段，用500 mg/L 的ABT-1 溶液浸泡30 min。（1）探究母樹年齡、留葉方式和基質(zhì)對扦插生根的影響，采用3因素3水平L9（34）正交試驗設(shè)計，試驗設(shè)計組合見表1。留葉方式有3種，方式L1保留頂芽和1 片葉，方式L2僅保留頂芽，方式L3去除頂芽保留新生側(cè)芽；扦插基質(zhì)有3 種，基質(zhì)S1為V（河沙）∶V（泥炭）=1∶1，基質(zhì)S2為V（河沙）∶V（黃泥土）=1∶1，基質(zhì)S3為V（黃泥土）∶V（木屑）=1∶1，共9 個處理，每個處理選擇100 株插穗，重復(fù)3 次。扦插35 d 后調(diào)查愈傷率，63 d 后調(diào)查各組生根率、根長等生長性狀指標(biāo)。（2）探究留葉方式對千年桐插穗生根過程根系性狀和生理的影響，將3 種不同留葉方式L1、L2和L3的插穗，扦插于河沙與黃心土同體積比的混合基質(zhì)中，共3 個處理，每個處理150株插穗，重復(fù)3 次，對生根過程進行拍照和顯微觀察，同時檢測頂芽、側(cè)芽和葉片相關(guān)生理指標(biāo)。

表1 正交試驗設(shè)計方案Tab.1 Orthogonal design plan

1.3 扦插及管理

試驗于2019 年3 月初開始，選用高約15 cm、直徑約6 cm 的無紡布袋盛放扦插基質(zhì)，扦插前2 d 基質(zhì)用0.5%高錳酸鉀溶液消毒后用托盤整齊地擺放在苗床上。插穗下端剪出平滑斜切面，用0.1%的多菌靈水溶液對插穗消毒10～15 min，清洗后將插穗下端浸泡于500 mg/L 的ABT-1溶液中30 min。扦插前需要用竹簽在基質(zhì)上打出約6 cm 深的引導(dǎo)洞，扦插時為了使基質(zhì)與插穗緊密貼合需要用手壓實插穗周圍基質(zhì)后澆透水。適時噴霧保持插穗及土壤濕潤，用噴霧器對插穗交替進行噴霧消毒，消毒劑為0.1%的多菌靈溶液和0.1%的高錳酸鉀溶液，及時清除枯落葉和壞死插穗，前期每5 d 消毒1 次，生根后每周消毒1次。

1.4 數(shù)據(jù)調(diào)查

（1）正交試驗數(shù)據(jù)調(diào)查。扦插35 d后統(tǒng)計插穗愈傷率。扦插63 d后，調(diào)查一級不定根的數(shù)量并測量根長，然后將根系殺青，放于60 ℃恒溫箱中烘烤20 h后稱量，精度為0.01 g。計算根系效果指數(shù)=（根系數(shù)量×平均根長）/插穗總數(shù)；對生根數(shù)、根系干質(zhì)量等指標(biāo)進行隸屬函數(shù)計算，隸屬函數(shù)為：R（Y）=（Y-Ymin）/（Ymax-Ymin），Y為不同處理的指標(biāo)測定值，Ymin和Ymax為某一指標(biāo)在所有處理中的最小值和最大值，對不同處理進行排名評價。

（2）不同留葉方式插穗根系生長和生理指標(biāo)調(diào)查。扦插后每周拍照觀察插穗生根情況，方法為抽取不同留葉方式的插穗，洗凈置于工作臺上進行拍照，并截取長約1 cm 基部莖段，保存于FAA 固定液中用于根系解剖結(jié)構(gòu)觀察研究，參照周乃富等[10]研究方法對樣品固定軟化，染色液為番紅-固綠，Olympus BX51顯微鏡觀察拍照。取扦插0，21，42，63 d時的樣品，截取插穗頂芽、側(cè)芽和葉片，采用安捷倫1260高效液相色譜儀串聯(lián)6420A 質(zhì)譜儀測定內(nèi)源IAA，ZR，ABA 和GA3含量，硫酸蒽酮法測定可溶性糖含量[11]，考馬斯亮藍比色法測定可溶性蛋白含量[12]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0和Excel 2016軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計及方差分析，對有顯著性差異的指標(biāo)進行Duncan’s多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 母樹年齡、留葉方式和基質(zhì)對千年桐插穗生根的影響

2.1.1 不同處理間根系生長指標(biāo)比較 扦插35 d后統(tǒng)計愈傷組織率，63 d后統(tǒng)計生根率、生根數(shù)等根系生長指標(biāo)，結(jié)果如表2所示。不同處理間根系生長性狀差異明顯，插穗愈傷率范圍為31.67%～68.17%，最長根長范圍為14.16～9.37cm，最高值出現(xiàn)在P1，最低值出現(xiàn)在P9；生根率范圍為26.63%～45.31%，根系干質(zhì)量范圍為0.087～0.160 g，根系效果指數(shù)范圍為1.19～2.72，最大值皆出現(xiàn)在P1，最小值皆出現(xiàn)在P6；生根數(shù)范圍為6.67～9.67 條，最大值出現(xiàn)在P3，平均根長范圍為4.02～6.01 cm，最大值出現(xiàn)在P1，其最小值皆出現(xiàn)在P7。P1選取1 年生插穗保留頂芽和1 片葉扦插于河沙+泥炭（1:1）混合基質(zhì)，其愈傷率、生根率、平均根長、最長根長、根系干質(zhì)量和根系效果指數(shù)均達到最高值，根系總體生長情況明顯優(yōu)于其他處理。生根數(shù)和最長根長在不同處理間差異不明顯。

表2 母樹年齡、留葉方式及基質(zhì)對千年桐插穗生根的影響Tab.2 Effects of the mother tree age，leaf retention and substrates on rooting ofVernicia montanacuttings

2.1.2 不同處理根系生長指標(biāo)差異分析 對根系生長性狀指標(biāo)進行方差分析，結(jié)果如表3所示。母樹年齡對愈傷率、平均根長和根系效果指數(shù)有極顯著影響（P<0.01），對生根率和根系干質(zhì)量有顯著影響（P<0.05）。留葉方式對愈傷率、生根率、根系干質(zhì)量和根系效果指數(shù)有極顯著影響，對最長根長有顯著影響。母樹年齡對插穗愈傷率的影響高于留葉方式，但對生根率的影響低于留葉方式。扦插基質(zhì)對插穗根系生長影響不顯著。

由表3 可知，母樹年齡和留葉方式對生根有顯著影響，對兩種因素不同水平間的根系生長指標(biāo)進行多重比較，結(jié)果如表4 所示。插穗的愈傷率、生根率、生根數(shù)和根系效果指數(shù)隨著母樹年齡的增加呈降低趨勢，即1 年生插穗>3 年生插穗>5 年生插穗，母樹年齡越高其根系生長愈差，1 年生插穗的愈傷率、生根率、平均根長和根系效果指數(shù)均顯著高于5 年生插穗（P<0.05）。保留頂芽和1 片葉（L1）的插穗，其愈傷率、生根率、最長根長、根系干質(zhì)量和根系效果指數(shù)皆高于僅保留頂芽（L2）和僅保留側(cè)芽（L3）的插穗，其中L1的平均根長、根系干質(zhì)量和根系效果指數(shù)均顯著高于L2和L3，L1和L2的愈傷率和生根率顯著高于L3（P<0.05），不定根總體生長規(guī)律為L1>L2>L3。

表3 不同處理對根系生長性狀指標(biāo)影響的方差分析Tab.3 Variance analysis of the effects of root growth characters indexes in different treatments

表4 母樹年齡和留葉方式和對千年桐插穗根系生長影響的LSD多重比較Tab.4 LSD multiple comparison of the effects of the mother tree age and leaf retention on cutting rooting pa?rameters ofVernicia montana

2.1.3 根系發(fā)育指標(biāo)的隸屬函數(shù)值及綜合評價 采用模糊數(shù)學(xué)中的隸屬函數(shù)分析法對千年桐不定根生長性狀指標(biāo)進行分析，根據(jù)隸屬函數(shù)值，對不同處理生根指標(biāo)進行綜合排名。結(jié)果如表5所示，最佳處理組合P1選取1 年生插穗保留頂芽和1 片葉，其平均隸屬函數(shù)值最高為0.949，P4選取3 年生插穗保留頂芽和一片葉，其平均隸屬函數(shù)值為0.692，略高于1 年生母樹插穗P2和P3，P6選取3 年生插穗僅保留側(cè)芽，P9選取5年生插穗僅保留側(cè)芽，其隸屬函數(shù)值最低分別為0.211和0.081。

表5 根系生長指標(biāo)隸屬函數(shù)值及綜合評價Tab.5 Membership function values and synthetic valuation of root development indicators

2.2 留葉方式對千年桐插穗生根過程根系性狀和生理的影響

2.2.1 不同留葉方式的插穗生根形態(tài)觀察 對扦插0，21，42，63 d 3 種留葉方式的插穗取樣進行拍照觀察，對比分析發(fā)現(xiàn)，（1）扦插0 d，不同留葉方式插穗生長狀態(tài)相同，葉片及莖段呈鮮綠色（圖l a，e，i）；（2）扦插21 d，L1處理切口開始愈合，基部產(chǎn)生較多愈傷組織（圖l b），L2和L3產(chǎn)生的愈傷組織較少（圖l f，j）；（3）扦插42 d，各處理基部愈傷組織比前期明顯增多，同時形成了不定根，且L1處理不定根生長狀況顯著優(yōu)于L2和L3（圖l c，g，k）；（4）扦插63 d 以后，不定根較前期伸長增粗，根系數(shù)量明顯增加，各處理間根系生長差異明顯，L1處理根系及插穗生長情況最優(yōu)（圖1 d，h，l）。

圖1 千年桐不同留葉方式插穗根系生長差異對比Fig.1 Comparison of root growth differences of different leaf retention cuttings ofVernicia montana

2.2.2 不同留葉方式的插穗解剖結(jié)構(gòu)顯微觀察對扦插14，28，35，42 d 3種留葉方式的插穗根系解剖結(jié)構(gòu)進行顯微觀察，對比分析發(fā)現(xiàn)，（1）扦插21 d，L1薄壁細胞出現(xiàn)了明顯的分裂分化，并開始向外產(chǎn)生類分生組織，形成排列緊密與周圍細胞有明顯區(qū)別的細胞團，即形成了根原基（圖2 a），L2和L3插穗維管形成層和韌皮部發(fā)現(xiàn)了開始分裂的根原始細胞，但此時形成層細胞剛剛恢復(fù)分生能力，周圍組織生長分化并不明顯（圖2 e，i）；（2）扦插28 d，L1根原基細胞團通過平周分裂和垂周分裂等，其形態(tài)發(fā)生了巨大變化，由開始的卵圓形變?yōu)樾ㄐ危⒊げ垦由欤▓D2 b），L2和L3插穗薄壁細胞也出現(xiàn)了明顯的分裂分化，形成了排列緊密與周圍細胞有明顯區(qū)別的細胞團，L2根原基分化優(yōu)于L3（圖2 f，j）；（3）扦插35 d，L1根原基繼續(xù)朝著韌皮部射線的方向生長，延伸到皮層區(qū)域，此時根原基可以區(qū)分出根冠、根尖和分生區(qū)，最外層表皮被不定根所突破（圖2 c），L2和L3根原基進行快速分裂分化，其形態(tài)發(fā)生了巨大變化，并朝著韌皮部射線的方向生長，延伸到皮層區(qū)域（圖2 g，k）；（4）扦插42 d，L1和L2根冠區(qū)域逐漸分化出維管組織，與插穗的維管系統(tǒng)相連形成完整的根結(jié)構(gòu)（圖2 d，h），L3根原基生長延伸到皮層區(qū)域，可以區(qū)分出根冠、根尖和分生區(qū)，最外層表皮被不定根所突破。

圖2 千年桐不同留葉方式的插穗解剖結(jié)構(gòu)變化Fig.2 Anatomical changes of the different leaf retention cuttings ofVernicia montana

2.2.3 留葉方式對插穗內(nèi)源激素含量的影響測定不同留葉方式插穗生根過程頂芽、側(cè)芽內(nèi)源激素含量變化，結(jié)果如圖3所示。不同處理生長素（IAA）含量變化趨勢大致相同，前期快速下降，扦插21 d降到最低值，生根之后其含量緩慢增加，扦插63 d，L1和L2處理IAA 含量逐漸接近扦插0 d 時的水平。玉米素核苷（ZR）含量總體變化為前期快速下降，后期緩慢上升，不同留葉方式的插穗ZR含量變化存在差異，L1和L2處理前期其含量一直呈下降趨勢，扦插42 d即不定根快速生長階段，其含量開始上升，L3處理ZR 含量呈現(xiàn)一定的波動。赤霉素（GA3）含量水平遠低于IAA 和ZR，含量總體呈上升趨勢，L1和L2的GA3含量含量前期下降，扦插21 d后含量逐漸上升，L3含量始終處于上升趨勢。不同處理脫落酸（ABA）含量總體變化趨勢相似，前期愈傷組織形成期ABA 含量快速上升，L1和L2處理扦插42 d 即不定根生長階段ABA 含量開始緩慢下降，L3處理ABA含量呈現(xiàn)一定波動，但始終保持較高水平。

圖3 留葉方式對千年桐插穗內(nèi)源激素含量的影響Fig.3 Effects of leaf retention on endogenous hormones of theVernicia montanacutting

2.2.4 留葉方式對插穗可溶性蛋白、可溶性糖含量的影響測定不同留葉方式的插穗生根過程葉片內(nèi)可溶性蛋白含量、可溶性糖含量變化，結(jié)果如圖4所示。不同處理間可溶性糖含量變化規(guī)律大致相同，留葉方式L2和L3扦插前期可溶性蛋白含量略微下降，之后呈增長趨勢，L1葉片中可溶性蛋白含量前中期呈增長趨勢，扦插42 d 其含量略微下降，但高于扦插0 d 時的水平。不同留葉方式的插穗可溶性糖含量變化規(guī)律存在差異，L2可溶性糖含量前期降低，扦插42 d 時即不定根快速生長階段時其含量達到最高值，后呈下降趨勢，L1可溶性含量呈現(xiàn)一定波動，但范圍較小，且含量始終保持較高水平，L3可溶性糖含量前中期始終緩慢下降，扦插42 d后即不定根快速生長階段，其含量開始上升趨于扦插0 d的水平。

圖4 留葉方式對千年桐插穗可溶性蛋白、可溶性糖含量的影響Fig.4 Effects of leaf retention on the content of soluble protein and soluble sugar ofVernicia Montanacutting

3 結(jié)論與討論

插穗生根過程與自身遺傳特性、生態(tài)學(xué)、生物學(xué)密切相關(guān)，同時受外界多種因素共同調(diào)控，是一個極其復(fù)雜的生理過程[13]。母樹年齡與不定根生成之間關(guān)系密切，插穗母樹年齡越大其木質(zhì)化程度越高，營養(yǎng)物質(zhì)含有量和含水量相對較低，不利于不定根的產(chǎn)生[14]。千年桐插穗生根過程也呈現(xiàn)了上述規(guī)律，即1 年生插穗>3 年生插穗>5 年生插穗，1 年生插穗根系生長情況顯著優(yōu)于5 年生插穗（P<0.05）。白磊等[15]對米老排扦插生根研究中發(fā)現(xiàn)，1 年生插穗生根率可達到81.7%，極顯著高于5 年生插穗約5.0%的生根率（P<0.01）；秦愛麗等[13]研究發(fā)現(xiàn)，母樹年齡越小，插穗生根效果越好。扦插基質(zhì)對插穗生根有重要影響，基質(zhì)成分決定其理化性質(zhì)差異較大，最佳的扦插基質(zhì)應(yīng)該具有保水、通氣和提供養(yǎng)分等作用[16-18]。干凈的河沙具有一定的通氣性、保溫性；泥炭具有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，有助于改善土壤結(jié)；黃泥土不易滋生細菌，保水性較好，但通氣性較差；木屑具有一定的通氣保溫作用，但保水性較差，容易滋生細菌。研究發(fā)現(xiàn)，千年桐插穗在不同基質(zhì)中根系生長差異不顯著，可能是本次研究的基質(zhì)組成過于簡單，亦或與千年桐扦插生根對基質(zhì)的要求有關(guān)，有待于進一步深入研究。

千年桐插穗保留頂芽和一定數(shù)量的葉片有助于其生根，留葉方式L1插穗生根情況顯著優(yōu)于L2和L3。對不同留葉方式的插穗生根過程進行拍照和顯微觀察，發(fā)現(xiàn)在同一時期，L1的不定根形成及根原基細胞的誘導(dǎo)分化明顯快于L2和L3，L1插穗能更快速地對外界植物生長調(diào)節(jié)劑產(chǎn)生響應(yīng)，其生根速率和生根數(shù)量也顯著高于L2和L3。對不同處理相關(guān)生理指標(biāo)進行檢測發(fā)現(xiàn)，其葉片、頂芽及側(cè)芽的內(nèi)源激素、可溶性蛋白和可溶性糖含量存在一定差異，且隨著不定根的生長不斷變化。葉片和頂芽可以產(chǎn)生光合作用為插穗提供有機營養(yǎng)，同時，葉片的蒸騰作用帶動了插穗內(nèi)物質(zhì)運輸促進生根，老葉為根系生長發(fā)育提供了75%的養(yǎng)分，生根所需的碳水化合物和內(nèi)源激素主要來源于葉片[20-24]。不同留葉方式插穗IAA 含量變化趨勢大致相同，前期快速下降，生根后含量緩慢增加，扦插63 d，IAA 含量與插穗生根率呈極顯著正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)IAA 在不定根生成過程中起著重要作用，主要作用于受體蛋白后通過轉(zhuǎn)運糖類等物質(zhì)來促進根原始細胞的分裂生長[25]。ZR 在不同生根時期作用不同，ZR 在根原始細胞分裂分化及愈傷組織形成過程中有所消耗，在不定根長出后，通過自身合成作用使其含量增加[26-27]，這與千年桐扦插生根研究結(jié)果相一致。千年桐插穗GA3含量水平遠低于IAA 和ZR，含量總體呈上升趨勢。研究發(fā)現(xiàn)GA3在生根過程中阻礙了生長素對根原基細胞的誘導(dǎo)，阻礙根原基進一步生長發(fā)育形成根系[28-30]。ABA 是植物體內(nèi)一種天然的抑制性植物激素，具有抑制細胞分裂的作用[31]。不同處理ABA含量總體變化趨勢相似，前期愈傷組織形成期ABA 含量快速上升，L1和L2扦插42 d 即不定根生長階段ABA 含量開始緩慢下降，L3處理ABA 含量呈現(xiàn)一定波動，但始終保持較高水平。插穗體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的水平對其不定根的產(chǎn)生有重要影響[32]，不同處理插穗可溶性糖含量緩慢上升，可溶性蛋白含量呈現(xiàn)一定波動，不斷變化的C/N 值對根系生長發(fā)育不同階段產(chǎn)生不同影響。在扦插生根過程中，離體的細胞、組織或器官其根系再生能力與年齡密切相關(guān)，母樹年齡越低插穗生根能力一般愈強，1 年生的千年桐插穗其生根能力顯著優(yōu)于5 年生插穗。千年桐插穗保留一定數(shù)量的葉片和頂芽，能有效地促進其扦插生根，這與葉片及頂芽產(chǎn)生的內(nèi)源激素和營養(yǎng)物質(zhì)密切相關(guān)，內(nèi)源物通過協(xié)同作用，共同促進插穗根原基細胞的生長發(fā)育，最后形成不定根。