GmXTH23基因的克隆及抗旱性鑒定

陳 龍，張沿政，李永光，李文濱

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/大豆生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部東北大豆生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150030）

【研究意義】據(jù)相關(guān)研究[1]，我國(guó)耕地面積中干旱與半旱地區(qū)約占45%。干旱災(zāi)害極大地限制了作物產(chǎn)量，使糧食嚴(yán)重減產(chǎn)。大豆的產(chǎn)量與品質(zhì)受干旱影響嚴(yán)重，因此，發(fā)掘優(yōu)質(zhì)的抗旱基因，是提高大豆抗旱性的有效途徑?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】木葡聚糖水解酶/內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶（XTH）是重構(gòu)細(xì)胞壁的重要物質(zhì)，其機(jī)制是通過(guò)催化作用，使木葡聚糖分子斷裂重連，對(duì)植物的纖維素-木葡聚糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾從而影響細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)[2]。按照序列特征，XTHs被劃分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類[3-4]，其中III類被劃分為IIIA和IIIB兩個(gè)小類[5]。IIIB類、I類和II類的XTHs能內(nèi)切木葡聚糖分子，產(chǎn)生還原性的末端，再和另一個(gè)木葡聚糖鏈相連接，其木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶（XET）活性非常顯著[5-7]。IIIA類則顯示出木葡聚糖水解酶（XEH）活性，專一水解木葡聚糖的β-1，4糖苷鍵。XTH酶的特征序列是DEIDFEFLG，此序列中包含了能夠介導(dǎo)催化活性的氨基酸殘基。該催化位點(diǎn)附近的蘇氨酸或絲氨酸殘基由N-糖基化修飾[7-8]，與酶活性有重大關(guān)聯(lián)。N-糖基化位點(diǎn)保守在IIIA亞類中未被發(fā)現(xiàn)[5]，但在XTHs蛋白I/II類中已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。XTHs蛋白的C-末端可以形成能夠穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的二硫鍵，因?yàn)槠渫ǔ：懈叨缺Ｊ氐陌腚装彼?。前人的研究成果[9]表明XTH與植物組織的的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)，如在擬南芥中AtXTH31參與了根的生長(zhǎng)伸長(zhǎng)；BcXTH1的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了花枝的生長(zhǎng)從而使得株高增加[10]；AtXTH15、19、16、17能夠通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞壁延展性來(lái)促進(jìn)葉柄伸長(zhǎng)[11]；在梨果成熟軟化過(guò)程中PC-XET1可能參與了細(xì)胞壁的降解[12]。近期有研究[13-15]表明XTH還受環(huán)境脅迫影響，如在重力作用下擬南芥中AtXTH22表達(dá)量明顯上升；在缺氧條件下，矮慈姑中的一些XTH基因表達(dá)上調(diào)[16];在擬南芥中xth15突變體與野生型相比，植株的耐鋁性提高[17]；過(guò)表達(dá)CaXTH3能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性和耐鹽性[18]。

【本研究切入點(diǎn)】通過(guò)本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，大豆基因GmXTH23在干旱脅迫下表達(dá)量顯著增加，但是在植物抗旱生理中行使的功能尚未明確。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本試驗(yàn)通過(guò)同源克隆的方法從墾豐16中得到基因GmXTH23；利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)基因在大豆不同組織內(nèi)和模擬干旱脅迫下的表達(dá)情況進(jìn)行分析；通過(guò)檢驗(yàn)?zāi)康幕蚺c黃色熒光蛋白同源重組質(zhì)粒的蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行基因亞細(xì)胞水平定位；利用蘸花法侵染擬南芥得到過(guò)表達(dá)株系，同時(shí)對(duì)過(guò)表達(dá)株系進(jìn)行干旱脅迫，觀察表型并測(cè)量相關(guān)生理指標(biāo)，驗(yàn)證GmXTH23基因在植物抗旱生理中的作用，探究其作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究GmXTH23基因功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 本研究所用大豆材料墾豐16，擬南芥材料是由實(shí)驗(yàn)室自行繁殖并保存的哥倫比亞野生型（Columbia-0）。

1.1.2 主要試劑 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、膠回收試劑盒、qRT-PCR 試劑盒、限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶均于Takara公司購(gòu)置。農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，大腸桿菌感受態(tài)DH5α均由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 大豆基因GmXTH23的克隆 采用Trizol 試劑提取大豆品種墾豐16 的幼葉的總RNA，用Takara 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用Prime5.0 設(shè)計(jì)特異性引物GmXTH23（表1）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物回收純化后，采用T4連接酶連接至線性化的pCXSN（XcmI單酶切）載體并進(jìn)行測(cè)序。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.2GmXTH23基因的組織表達(dá)及脅迫下的表達(dá)模式分析 將墾豐16大豆培養(yǎng)于長(zhǎng)日照（16 h光照/8 h黑暗），25 ℃條件下，當(dāng)幼苗第2片三出復(fù)葉完全展開(kāi)時(shí)，將幼苗挖出，水培24 h后分成兩份，取一份置入含有5%PEG6000的水培液中，一份置于正常水培液中，分別取處理0，2，4，6，8，12，24，48 h的植物葉片，液氮迅速冷凍后保存于-80 ℃冰箱。提取以上樣本的總RNA 將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并將其作為模板，根據(jù)GmXTH23的序列信息設(shè)計(jì)定量引物qtGmXTH23（表1）進(jìn)行qRT-PCR 分析，內(nèi)參基因選用大豆持家基因Actin4。

1.2.3 GmXTH23 蛋白亞細(xì)胞定位 以1.2.1 中得到的GmXTH23膠回收產(chǎn)物為模板，以GmXTH23-YFP（表1）為引物擴(kuò)增得目的片段，與YFP載體相連，測(cè)序比對(duì)。利用基因槍法將重組質(zhì)粒在洋蔥表皮細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，為了更準(zhǔn)確地得到GmXTH23蛋白的定位信息，采用蔗糖溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)壁分離，再次觀察GmXTH23-YFP的表達(dá)情況。

1.2.4GmXTH23的遺傳轉(zhuǎn)化 將1.2.1 中得到的過(guò)表達(dá)載體pCXSN-GmXTH23采用凍融法將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101 中。利用蘸花法侵染野生型擬南芥，得到T0 代過(guò)表達(dá)擬南芥株系并將其種子在含有草銨膦的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，繁殖得到T3代基因純合的過(guò)表達(dá)株系用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.5 表型試驗(yàn) 將野生型與T3 代純合的過(guò)表達(dá)株系種子經(jīng)10%次氯酸鈉溶液消毒6 min 后，在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)用無(wú)菌水洗滌5 次，點(diǎn)播于含有0，100，200，300 mmol/L 甘露醇的MS 培養(yǎng)基中，避光春化3 d 后正常培養(yǎng)4 d，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率；將野生型與T3 代純合的過(guò)表達(dá)株系種子正常點(diǎn)播于MS 培養(yǎng)基上，避光春化3 d 后黑暗培養(yǎng)3 d，取出后置于含有0，100，200，300 mmol/L 甘露醇的MS 培養(yǎng)基中豎直培養(yǎng)7 d 后統(tǒng)計(jì)根長(zhǎng)；將野生型與T3代純合的過(guò)表達(dá)株系種子點(diǎn)播于營(yíng)養(yǎng)土中，一部分正常培養(yǎng)，另一部分在正常培養(yǎng)4周后停止?jié)菜M(jìn)行干旱處理，兩周后統(tǒng)計(jì)表型、測(cè)定相關(guān)指標(biāo)，復(fù)水4 d后再次統(tǒng)計(jì)存活率。

1.2.6 相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 測(cè)定參照的方法：用茚三酮比色法測(cè)定游離脯氨酸含量，氮藍(lán)四唑法測(cè)定超氧化物歧化酶含量，硫代巴比妥酸比色法測(cè)定丙二醛含量。

2 結(jié)果分析

2.1 基因GmXTH23的克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

以在Phytozome 中查詢到的大豆品種Williams 82的基因組序列為參考，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物GmXTH23。以大豆品種墾豐16 總cDNA 作為模板，經(jīng)PCR 擴(kuò)增得到一條長(zhǎng)度為875 bp 左右的序列（圖1A）。將目的條帶膠回收純化后連接至pCXSN載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α并通過(guò)菌液PCR鑒定后（圖1B）送往測(cè)序公司測(cè)序，結(jié)果與基因GmXTH23參考序列完全匹配。

圖1 基因GmXTH23的克隆及菌液PCR鑒定Fig.1 Cloning and PCR identification ofGmXTH23gene

2.2 基因GmXTH23不同組織和逆境脅迫下表達(dá)模式分析

利用qRT-PCR 對(duì)基因GmXTH23在墾豐16不同組織中的表達(dá)模式和干旱處理下的響應(yīng)模式進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在大豆的莢、果實(shí)、葉片、根部、莖中皆有表達(dá)，并且在莖中表達(dá)量最高（圖2A）。

經(jīng)5%PEG6000 處理之后，與CK 相比GmXTH23的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后下降再逐漸升高的趨勢(shì)，并在脅迫24 h時(shí)達(dá)到最高（圖2B）。

圖2 GmXTH23在不同組織間和干旱脅迫后的表達(dá)模式分析Fig.2 Analysis ofGmXTH23expression patterns between different tissues and after drought stress

2.3 GmXTH23蛋白的亞細(xì)胞定位

為了探究GmXTH23蛋白的定位特征，利用基因槍法將構(gòu)建好的35S::GmXTH23::YFP融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。

通過(guò)激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)35S::YFP空載體在整個(gè)細(xì)胞中皆表達(dá)熒光信號(hào)，初步確定35S::GmXTH23:YFP熒光信號(hào)分布細(xì)胞膜上。進(jìn)一步使用蔗糖溶液進(jìn)行質(zhì)壁分離后，再次觀察發(fā)現(xiàn)GmXTH23-YFP重組蛋白確實(shí)定位于細(xì)胞膜上（圖3）。

2.4 轉(zhuǎn)基因GmXTH23擬南芥抗旱性鑒定

將GmXTH23轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)株系T3代種子與野生型種植于含有0，100，200，300 mmol/L甘露醇的MS培養(yǎng)基中。發(fā)現(xiàn)在不同濃度的甘露醇脅迫下，過(guò)表達(dá)株系的發(fā)芽率顯著高于野生型（圖4）。

圖3 GmXTH23亞細(xì)胞定位情況Fig.3 GmXTH23subcellular localization

圖4 轉(zhuǎn)基因擬南芥干旱脅迫后的萌發(fā)情況（A）及萌發(fā)率（B）Fig.4 Germination of transgenicarabidopsis thalianaunder drought stress（A）and germination rate（B）

將在正常條件下的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)的T3代GmXTH23轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥轉(zhuǎn)移至含有不同濃度甘露醇的MS 培養(yǎng)基中，豎直培養(yǎng)7 d，測(cè)量不同株系擬南芥的根長(zhǎng)。結(jié)果表明在MS 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的各株系擬南芥根長(zhǎng)基本一致，而在含有不同濃度的甘露醇的MS 培養(yǎng)基中，過(guò)表達(dá)株系的根長(zhǎng)皆顯著大于野生型（圖5）。

圖5 轉(zhuǎn)基因擬南芥干旱脅迫下根生長(zhǎng)情況（A）及長(zhǎng)度（B）Fig.5 Root growth of transgenicarabidopsis thalianaunder drought stress（A）and length（B）

圖6 干旱逆境下轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長(zhǎng)狀況（A）和存活率（B）Fig.6 Growth status and survival rate of transgenicarabidopsis thalianaunder drought（A）and stress（B）

將GmXTH23轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)株系和野生型種植在長(zhǎng)日照條件下培養(yǎng)四周，沒(méi)有明顯的表型差異。在停止?jié)菜?周后發(fā)現(xiàn)四個(gè)株系皆出現(xiàn)不同程度的萎蔫，過(guò)表達(dá)株系OE1、OE2萎蔫程度較輕，OE3程度較重一些，在復(fù)水4 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)58%的過(guò)表達(dá)植株恢復(fù)正常生長(zhǎng)，只有18%的野生型植株恢復(fù)正常生長(zhǎng)（圖6）。以上結(jié)果表明轉(zhuǎn)GmXTH23基因的過(guò)表達(dá)株系的抗旱性有所提高。

2.5 相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定

取上述干旱脅迫試驗(yàn)后不同株系的擬南芥葉片，進(jìn)一步測(cè)量其PRO、MDA、SOD含量，發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過(guò)干旱脅迫后，野生型與過(guò)表達(dá)株系各項(xiàng)指標(biāo)皆有差異，過(guò)表達(dá)株系與野生型株系相比其PRO含量與SOD含量較高（圖7A，C），MDA 含量較低（圖7B）。結(jié)果表明在干旱脅迫下GmXTH23通過(guò)提高脯氨酸與超氧化物歧化酶含量、降低植物細(xì)胞在脅迫下的損傷來(lái)提高植物的抗旱性。

圖7 干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定Fig.7 Determination of related physiological indicators of transgenicarabidopsis thalianaunder drought stress

3 討論

半纖維素是細(xì)胞壁構(gòu)成的主要成分之一，由木葡聚糖構(gòu)成主鏈，由植物細(xì)胞中的高爾基體合成，囊泡將其轉(zhuǎn)送至細(xì)胞膜，與細(xì)胞膜結(jié)合后分泌到細(xì)胞外參與細(xì)胞壁的生理代謝[19]。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，GmXTH23 蛋白定位于細(xì)胞膜處，推測(cè)其和半纖維素與細(xì)胞膜的結(jié)合或分泌到細(xì)胞外時(shí)的生理活動(dòng)有關(guān)。在其他作物中也有類似研究，比如ZmXTH1在分泌途徑和細(xì)胞壁均有檢測(cè)到其蛋白，說(shuō)明其在蛋白的分泌過(guò)程中發(fā)揮作用[20]。

脯氨酸作為一種較理想的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，不僅可以改善細(xì)胞膜的水環(huán)境，使膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性增強(qiáng)，還會(huì)在植物受到逆境脅迫時(shí)在體內(nèi)大量累積，因此脯氨酸含量可以作為抗旱育種的一項(xiàng)重要生理指標(biāo)[21]。在干旱處理下，經(jīng)過(guò)測(cè)定，相對(duì)于野生型，GmXTH23轉(zhuǎn)基因擬南芥含有更高的脯氨酸含量，推測(cè)GmXTH23能夠通過(guò)提高脯氨酸含量來(lái)提高植物調(diào)節(jié)的能力進(jìn)而提高植物的抗旱性。丙二醛是膜質(zhì)過(guò)氧化作用的產(chǎn)物之一，其含量多少代表了膜質(zhì)過(guò)氧化的嚴(yán)重程度[22]；在干旱脅迫下，植物體內(nèi)會(huì)累積較多的活性氧，從而導(dǎo)致細(xì)胞遭受膜質(zhì)過(guò)氧化、膜系統(tǒng)被破壞、蛋白質(zhì)變性等多種細(xì)胞毒害?；钚匝跚宄复傧到y(tǒng)中的超氧化物歧化酶（SOD）主要作用就在于它能將超氧陰離子自由基快速歧化為過(guò)氧化氫（H2O2）和分子氧；過(guò)氧化氫酶（CAT）是清除H2O2的主要酶類，保護(hù)細(xì)胞避免因累積H2O2而受到損傷，從而控制細(xì)胞中的活性氧含量，提高植物抗旱性[23]，所以植物體內(nèi)MDA與SOD的含量也是植物抗旱性的重要生理指標(biāo)。

本研究初步驗(yàn)證了GmXTH23能提高植物的抗旱性，為大豆抗旱育種提供了理論依據(jù)。但是對(duì)于基因的生理機(jī)制和作用途徑尚未清晰，如該基因具體是如何參與細(xì)胞壁相關(guān)的生理活動(dòng)、在干旱脅迫下調(diào)節(jié)機(jī)制與途徑、在其他脅迫途徑中起到何種作用，這些問(wèn)題對(duì)深入探究該基因功能有著啟示作用。

致謝：農(nóng)業(yè)部東北大豆生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室張宇航和王雪松在試驗(yàn)中給予了指導(dǎo)，謹(jǐn)致謝意！