黔北麻羊不同組織中FABP1、FABP3 基因表達(dá)水平的研究

艾錦新，龍安炬，羅衛(wèi)星，蔡惠芬*

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025；2.高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550025）

脂肪酸結(jié)合蛋白（Fatty Acid Binding Proteins，F(xiàn)ABPs）是胞內(nèi)脂質(zhì)結(jié)合蛋白超家族成員[1-2]，參與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的運(yùn)輸和體內(nèi)脂肪的合成與降解[3],對細(xì)胞信號傳導(dǎo)、增殖及分化具有重要的調(diào)控作用[4-5]。目前為止，至少已經(jīng)在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)9 種FABPs，按發(fā)現(xiàn)時(shí)間的前后順序和表達(dá)的組織特異性，可分為FABP1（肝臟型）、FABP2（小腸型）、FABP3（心臟型）、FABP4（脂肪型）、FABP5（表皮型）、FABP6（回腸型）、FABP7（腦型）、FABP8（髓鞘型）和FABP9（睪丸型）[6]。FABP1 主要在哺乳動(dòng)物肝臟和小腸中表達(dá)[7]；FABP3主要在哺乳動(dòng)物心肌、骨骼肌和脂肪細(xì)胞中表達(dá)[8]。俞英等[9]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP1基因在雜種雞CD（正交組合雞）、DC（反交組合雞）肝臟組織中的表達(dá)量均明顯高于親本純種雞CC（絲羽烏雞）和DD（農(nóng)大褐蛋雞），由此推測FABP1基因高表達(dá)導(dǎo)致雜種雞的脂肪沉積高于親本純種雞。高妍等[10]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP1基因外顯子2 的SNP 位點(diǎn)與松遼黑豬的大理石紋和肌內(nèi)脂肪含量顯著相關(guān)。朱夢婷等[11]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP3基因在黃羽肉雞的胸肌、腿肌和腹脂中均有不同程度的表達(dá)。岳彩娟等[12]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP3基因表達(dá)量與灘羊股二頭肌、背最長肌及腰大肌的肌內(nèi)脂肪（IMF）含量呈正相關(guān)。

黔北麻羊是貴州優(yōu)良的地方山羊品種[13-14]，但與國外優(yōu)質(zhì)肉羊相比仍存在個(gè)體偏小、產(chǎn)肉性能低等缺點(diǎn)。本研究以黔北麻羊?yàn)檠芯繉ο螅胵RT-PCR 技術(shù)檢測FABP1、FABP3基因在各個(gè)組織中的表達(dá)水平，以期豐富黔北麻羊肉質(zhì)性狀相關(guān)基因的遺傳信息數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步探究FABP1、FABP3基因在羊生長發(fā)育和脂肪沉積中的調(diào)控作用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源于貴州省習(xí)水縣富興牧業(yè)有限公司，選取6 月齡、1 周歲、1.5 周歲飼養(yǎng)管理?xiàng)l件相同且健康無病的公、母黔北麻羊各3 只，在現(xiàn)場屠宰后快速采集各個(gè)組織（心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃臟、下丘腦、十二指腸、胸腺、背最長肌和皮下脂肪），分別用DEPC 水清洗上述11 個(gè)組織，隨后置于裝有RNA 保存液的凍存管中，投入液氮罐內(nèi)快速冷凍后帶回實(shí)驗(yàn)室-80℃冰箱長期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器 主要試劑：Trizol 試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green（ROX qPCR mix）熒光染料Mix 購自Thermo 公司，2×Taq PCR MasterMix、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京鼎國生物技術(shù)工程有限公司，無水乙醇購自天津富宇精細(xì)化工有限公司，氯仿購自重慶川東化工有限公司。主要儀器：普通梯度PCR 擴(kuò)增儀、RT-PCR 儀（CFX96 型）均購自Bio-Rad 公司，DYY-2C 型電泳槽、電泳儀購自北京六一儀器廠，超微量紫外分光光度計(jì)（NanoDrop-2000型）購自Thermo 公司。

1.3 組織總RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)TaKaRa 公司Trizol 試劑盒說明書，分別提取黔北麻羊各組織的總RNA，用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性，將各組織RNA 濃度稀釋到1 000 ng/ μL，置于-80℃冰箱中保存；反轉(zhuǎn)錄合成黔北麻羊各組織的cDNA，經(jīng)超微量紫外分光光度計(jì)檢測其cDNA 的濃度及完整性，保存于-20℃冰箱中備用。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank 中山羊FABP1基因（登錄號：NM_001287558.1）和FABP3基因（登錄號：NM_001285701.1）的mRNA 序列設(shè)計(jì)qRT-PCR特異性引物，進(jìn)行黔北麻羊FABP1和FABP3基因RTPCR 擴(kuò)增，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參基因。利用Primer5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列信息見表1。引物均由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

表1 引物序列

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 普通PCR 和熒光定量PCR 檢測熒光引物特異性，摸索最佳反應(yīng)溫度和程序。采用SYBR Green 熒光染料法，PCR 反應(yīng)體系為10 μL：賽默飛SYBR Green（ROX qPCR mix）5 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA 模板1 μL，ddH2O 3.2 μL。PCR反應(yīng)條件：50℃ 2 min，95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃15 s，72℃ 1 min，共40 個(gè)循環(huán)；循環(huán)40 次后進(jìn)行熔解曲線分析：95℃ 5 s，65℃ 5 s，溫度以每5 s 遞增0.5℃的速率從65℃上升到95℃。每個(gè)待測樣品做3 個(gè)重復(fù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 從熒光定量PCR 儀中導(dǎo)出實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，運(yùn)用Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理與統(tǒng)計(jì)；采用2-△△Ct方法計(jì)算FABP1、FABP3基因在黔北麻羊不同組織中的相對表達(dá)量；利用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05 表示差異顯著，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA 及PCR 檢測結(jié)果 用1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測黔北麻羊不同組織總RNA，結(jié)果見圖1，總RNA 條帶清晰明亮，說明RNA 純度較高、完整性較好。選取黔北麻羊肝臟和心臟組織樣cDNA，經(jīng)PCR 擴(kuò)增后以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其產(chǎn)物，得到FABP1、FABP3、GAPDH基因目的條帶與預(yù)期相符，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 不同性別黔北麻羊FABP1基因的組織表達(dá)差異如圖2 所示，F(xiàn)ABP1基因在黔北麻羊不同組織中均能檢測到表達(dá)，以脾臟組織為對照，F(xiàn)ABP1基因在黔北麻羊肝臟中的表達(dá)量最高，其次是十二指腸和肺臟，而在心臟、脾臟、腎臟、胃臟、背最長肌、皮下脂肪、胸腺、下丘腦中的表達(dá)量都較低。不同性別中，F(xiàn)ABP1基因的表達(dá)量存在一定差異，母羊肝臟、十二指腸、皮下脂肪組織中FABP1基因的表達(dá)量顯著高于公羊，但在母羊背最長肌、下丘腦組織中FABP1基因的表達(dá)量卻顯著低于公羊，在其他組織中公、母羊FABP1基因的表達(dá)量均差異不顯著。

2.3 不同生長時(shí)期黔北麻羊FABP1基因的組織表達(dá)差異 根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析（表2），不同生長時(shí)期黔北麻羊FABP1基因的組織表達(dá)量存在顯著性差異，以脾臟組織為對照，6 月齡公、母羊心臟、肝臟組織中FABP1基因的表達(dá)量顯著低于1 周歲和1.5周歲，1 周歲和1.5 周歲之間差異不顯著。1.5 周歲公、母羊脾臟、下丘腦組織中FABP1基因的表達(dá)量顯著高于6 月齡和1 周歲，6 月齡和1 周歲差異不顯著。6 月齡、1 周歲和1.5 周歲母羊肺臟、腎臟、胃臟、十二指腸、皮下脂肪中FABP1基因的表達(dá)量無顯著差異。公羊肺組織中FABP1基因的表達(dá)量顯著高于1.5 周歲，6 月齡與其他2 個(gè)時(shí)期差異不顯著；公羊腎臟中FABP1基因的表達(dá)量顯著高于6 月齡和1.5 周歲，6 月齡和1.5周歲差異不顯著；6 月齡公羊十二指腸中FABP1基因的表達(dá)量顯著低于1 周歲和1.5 周歲，1 周歲和1.5 周歲差異不顯著；1.5 周歲公羊皮下脂肪、胃中FABP1基因的表達(dá)量顯著高于6 月齡和1 周歲。1 周歲公、母羊胸腺組織中FABP1基因的表達(dá)量顯著高于6 月齡和1.5周歲，6 月齡和1.5 周歲差異不顯著。不同生長時(shí)期公、母羊背最長肌中FABP1基因的表達(dá)量無顯著性差異。

2.4 不同性別黔北麻羊FABP3基因的組織表達(dá)差異如圖3 所示，F(xiàn)ABP3基因在黔北麻羊不同組織中均能檢測到表達(dá)，以背最長肌為對照，F(xiàn)ABP3基因在黔北麻羊心臟中的表達(dá)量最高，其次是腎臟和背最長肌，而在肝臟、脾臟、肺臟、十二指腸、皮下脂肪、胃臟、胸腺、下丘腦中表達(dá)量都較低。不同性別中，F(xiàn)ABP3基因的表達(dá)量存在一定差異，母羊心臟、皮下脂肪、胸腺組織中FABP3基因的表達(dá)量顯著高于公羊，但在母羊腎臟組織中FABP3基因的表達(dá)量顯著低于公羊，在其他組織中公、母羊FABP3基因的表達(dá)量差異不顯著。

2.5 不同生長時(shí)期黔北麻羊FABP3基因的組織表達(dá)差異 由表3 可見，不同生長時(shí)期黔北麻羊FABP3基因的組織表達(dá)量存在顯著差異，以背最長肌為對照。6 月齡公、母羊心臟、腎臟、肝臟、胃臟、十二指腸及背最長肌中FABP3基因的表達(dá)量均顯著低于1 周歲和1.5周歲，1 周歲和1.5 周歲差異不顯著；6 月齡、1 周歲和1.5 周歲公、母羊脾臟中FABP3基因的表達(dá)量差異不顯著；1.5 周歲黔北麻羊公、母羊皮下脂肪、胸腺中FABP3基因的表達(dá)量顯著高于6 月齡和1 周歲，6 月齡和1 周歲差異不顯著；1.5 周歲公、母羊肺臟、下丘腦中FABP3基因的表達(dá)量顯著高于6 月齡，1 周歲與6 月齡、1.5 周歲無顯著性差異。

表2 不同生長時(shí)期黔北麻羊FABP1 基因在各組織中的差異表達(dá)

表3 不同生長時(shí)期黔北麻羊FABP3 基因在各組織中的差異表達(dá)

3 討 論

肌內(nèi)脂肪含量作為影響畜禽肉質(zhì)的主要因素之一，增加肌內(nèi)脂肪含量可以改善肉質(zhì)風(fēng)味。而FABPs 能特異性地結(jié)合游離脂肪酸和其他疏水基團(tuán)，將細(xì)胞內(nèi)脂肪酸運(yùn)送到甘油三酯和磷酯合成或分解的部位，促進(jìn)脂化反應(yīng)的進(jìn)行及甘油三酯的重新合成，從而增加肌內(nèi)脂肪含量[5]。FABPs 基因編碼脂肪酸結(jié)合蛋白，而脂肪酸結(jié)合蛋白是影響脂肪沉積的重要基因，對機(jī)體脂肪代謝具有重要調(diào)控作用[7]。因此，通過探究FABP1和FABP3基因的組織表達(dá)規(guī)律，運(yùn)用分子生物技術(shù)手段提高肌內(nèi)脂肪含量，可以在保持較高產(chǎn)肉性能的前提下提高肉品質(zhì)。目前，對于FABP1和FABP3基因的研究大多集中在豬、牛、雞等動(dòng)物上，而在山羊的研究鮮見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP1和FABP3基因在黔北麻羊不同組織中均有表達(dá)，其中FABP1基因在黔北麻羊肝臟中相對表達(dá)量最高，其次是十二指腸和肺臟；FABP3基因在黔北麻羊心臟中相對表達(dá)量最高，其次是背最長肌和腎臟；在不同性別黔北麻羊各組織的表達(dá)中，F(xiàn)ABP1和FABP3基因在黔北麻羊母羊各組織中的表達(dá)量普遍高于公羊；在不同生長時(shí)期黔北麻羊各組織的表達(dá)中，F(xiàn)ABP1和FABP3基因表達(dá)量隨黔北麻羊月齡的增加呈現(xiàn)小幅度上升趨勢。

對FABP1基因在黔北麻羊各組織的表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)FABP1基因在肝臟和十二指腸的表達(dá)最為豐富，這與Hittel 等[15]研究FABP1基因在小鼠肝細(xì)胞和小腸黏膜細(xì)胞胞質(zhì)中高豐度表達(dá)的研究結(jié)果相一致。姜延志等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在豬各個(gè)組織中均能檢測到FABP1基因的表達(dá)，但其在肝臟組織中的表達(dá)量最高。石慧等[17]采用Westernblot 技術(shù)對雞FABP1基因的組織表達(dá)特性進(jìn)行分析，結(jié)果僅檢測到FABP1基因在肝臟和小腸中有較高表達(dá)，在其他組織未檢測到表達(dá)。結(jié)合本研究結(jié)果，F(xiàn)ABP1基因在肝臟的表達(dá)最豐富與前面研究結(jié)果相符，這可能是與肝臟需要FABP1參與脂肪酸的攝取、運(yùn)輸以及長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)化為甘油三酯有關(guān)[15]。對不同生長時(shí)期黔北麻羊背最長肌的FABP1基因表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)FABP1基因的表達(dá)量隨著年齡的增加緩慢上升，這與鄭程莉[18]研究FABP1基因在天府肉羊背最長肌呈下降-上升-下降的表達(dá)結(jié)果存在差異，可能是由于分組差異、羊種遺傳基礎(chǔ)及飼養(yǎng)環(huán)境不同所致。在整個(gè)生長階段中，F(xiàn)ABP1基因的表達(dá)量均處在一個(gè)較低水平，這可能與FABP1對軟脂酸鹽、油酸和硬脂酸鹽等長鏈脂肪酸具有高度親和力[15]，參與脂肪酸的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)會(huì)降低其表達(dá)量相關(guān)。

對FABP3基因在黔北麻羊各組織的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)FABP3基因在心臟的表達(dá)量最高，其次是背最長肌，這與胡江等[19]研究FABP3基因在甘南牦牛各組織的相對表達(dá)量結(jié)果相一致。但韓英等[20]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP3基因在興凱湖翹嘴鲌的肝臟和胰臟中表達(dá)量最高，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異，可能是由于物種跨度過大所致。趙雪等[21]研究綿羊FABP3基因的組織表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP3基因在腿部半腱肌、背最長肌中表達(dá)量最高，其次才是心臟；黃河等[22]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP3基因在藏豬心臟的表達(dá)量高于背最長肌，背最長肌的表達(dá)量高于肝臟；鄧龍華等[23]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP3基因在雞心臟的表達(dá)量為最高，其次是腿肌；周泉勇等[24]研究發(fā)現(xiàn)FABP3基因主要在黑玉山豬心、腎、脂肪和骨骼肌組織中表達(dá)，且在心臟組織中的表達(dá)量最高。綜合上述研究成果并結(jié)合本研究結(jié)果分析，F(xiàn)ABP3基因在心臟的表達(dá)量最高，其次是骨骼肌，肝臟表達(dá)量最低，說明FABP3基因具有組織表達(dá)特異性。對FABP3基因在不同生長時(shí)期黔北麻羊背最長肌的表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)FABP3基因的表達(dá)量隨著年齡的增加緩慢上升，這與郝稱莉等[25]研究FABP3基因在湖羊背最長肌呈上升-下降-上升的表達(dá)結(jié)果不同，可能是由于年齡段差異、品種及飼養(yǎng)環(huán)境不同造成。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)FABP1、FABP3基因在不同性別黔北麻羊背最長肌中的表達(dá)量存在顯著差異，公羊FABP1基因的表達(dá)量顯著高于母羊，母羊FABP3基因的表達(dá)量顯著高于公羊，這與孫偉等[26]研究GHR 和IGF-1 基因表達(dá)在湖羊肌肉中的發(fā)育性變化存在相似之處，說明了性別和年齡對基因在肌肉中的表達(dá)具有重要影響。從FABP1基因在肝臟和十二指腸表達(dá)量最高、FABP3基因在肝臟和十二指腸表達(dá)量較低、FABP3基因在心臟和背最長肌表達(dá)量最高、FABP1基因在心臟和背最長肌表達(dá)量較低的表達(dá)規(guī)律來看，F(xiàn)ABP1基因和FABP3基因之間可能存在拮抗作用，但還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，F(xiàn)ABP1、FABP3基因廣泛表達(dá)于黔北麻羊各組織中，其中FABP1基因在肝臟表達(dá)量最高，在心臟表達(dá)量極少，F(xiàn)ABP3基因在心臟表達(dá)量最高，在肝臟表達(dá)量極少，推測二者可能存在拮抗作用。在不同性別中，母羊不同組織的FABP1、FABP3基因表達(dá)量普遍高于公羊；在不同生長時(shí)期，F(xiàn)ABP1、FABP3基因的表達(dá)量會(huì)隨月齡的增加而逐漸上升。